Page 209 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 覃晓曼，等：基于全基因组测序分析大口黑鲈鰤诺卡氏菌致病性和耐药性 50 卷

3 min，95 ℃ 变性 10 s，55 ℃ 退火 10 s，72 ℃ 延 肾脏、脾脏等组织表面出现白色结节。采集病变
伸 2 min，30 个循环，72 ℃ 延伸 10 min。 组织进行 PCR 病原检测。结果显示，嗜水气单胞
1.9 耐药性分析 菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、类志贺邻单
胞菌的引物均未得到目的产物，鰤诺卡氏菌的引
生物被膜形成能力测定 采用 96 孔微量
物扩增得到目的产物，与鰤诺卡氏菌阳性对照一
板结晶紫染色法测定分离菌株的生物被膜形成能
致 (图 1)，表明发病大口黑鲈疑似鰤诺卡氏菌感染。
力 [26] 。将培养 5 d 的菌液按照 1∶100 转接到 BHI

液体培养基中，取 200 μL 加入到 96 孔微量板中， bp M 1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10
2 000
以 BHI 液体培养基作为阴性对照；在 28 ℃ 恒温
1 000
培养箱静置培养 15 d，吸弃菌液，然后用 200 μL 750
500
干净的 PBS 清洗 3 次；在空气中吹干平板，每孔 250
100
加 1% 结晶紫 200 μL，染色 5 min，小心清洗掉结晶
紫染液后将培养板倒置以除去残留液体；每孔加 图 1 病鱼样品的特定病原检测
入 200 μL 33% 冰 醋 酸 溶 解 0.5 h， 酶 标 仪 测 M. marker；1. 温和气单胞菌；2. 维氏气单胞菌；3. 鰤诺卡氏菌；
4. 嗜水气单胞菌；5. 类志贺邻单胞菌；6～10. 病鱼样品。
OD 590n m 值 。 根 据 ODc 的 临 界 值 (ODc=对 照 Fig. 1 Detection of specific pathogens in
OD 590n m 的平均值) 判断：细菌OD 590nm ＜ODc 时，
diseased M. samples
无 生 物 被 膜 形 成 力 ； ODc＜ 细 菌 OD 590nm ≤ M. marker; 1. A. sobria; 2. A. veronii; 3. N. seriolae; 4. A. hydrophila; 5.
2ODc 时 ， 生 物 被 膜 形 成 力 弱 ； 2ODc＜ 细 菌 P. shigelloides; 6-10. infected sample.
OD 590nm ≤4ODc， 生 物 被 膜 形 成 力 中 等 ； 细 菌
OD 590nm ＞4ODc，生物被膜形成力强。利用 SPSS 2.2 分离菌株生理生化鉴定
和 GraphPad Prism 8.0 软件分别进行显著性差异分
分离菌株氧化酶呈阴性，过氧化氢酶呈阳性，
析及柱状图制作。
可还原硝酸盐，能产生脲酶；水解七叶灵，不水
耐药基因分析 利用综合性抗生素抗性
解淀粉、明胶；能以柠檬酸盐为唯一碳源生长，
(Comprehensive Antibiotic Resistance Database，
不能利用阿拉伯糖、山梨醇和甘露醇；同时该菌
CARD) 基 因 数 据 库 (http://arpcard.Mcmaster.ca,
不能在 35 ℃ 及以上温度生长；分离菌株与参照
[27]
Version 1.1.3) ，对分离菌株 NS01 携带耐药基因
菌株鰤诺卡氏菌 SD1810 的理化特性相似。
进行筛选，设定比对期望值为 1e−5。为了比较分
离菌株 NS01 的耐药基因与其他鰤诺卡氏菌之间 2.3 分离菌株的形态特征
携带的耐药基因的差异，使用 CARD 数据库检索 分离菌株在 BHI 固体培养基上 28 ℃ 培养 3 d，
分离菌株 NS01 与其他 24 株鰤诺卡氏菌的抗生素
生长出淡黄色或白色小单菌落，6~8 d 后菌落表面
耐药性相关的基因片段，以 R package 用于统计分
粗糙，呈不规则雪花状 (图版Ⅰ-1)。挑取单菌落
析和图片绘制 (https://www.r-project.org/)。
在 BHI 液体培养基中，28 ℃ 振荡培养 5 d 菌体沉
药物敏感性测定 药物敏感性测定采用 K-
于底部，培养基液体清澈，振荡试管可见明显雪
B 琼脂法。将培养 5 d 的菌株用 PBS 调整至 1.0×
花状菌落 (图版Ⅰ-2)。分离菌株纯培养物经革兰
8
10 CFU/mL，用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布在
氏染色在光学显微镜下观察，可见呈蓝紫色的革
BHI 固体培养基上，将不同抗菌药物纸片贴在培
兰氏阳性杆菌 (图版Ⅰ-3)。对分离菌株进行扫描
养基上，28 ℃ 恒温培养 6 d 后测定抑菌圈直径；
电镜观察，其形态不规则，呈分支杆状 (图版 Ⅰ-4)。
结果判断采用杭州微生物试剂有限公司制定的药
分离菌株符合鰤诺卡氏菌的微观形态特征。
敏标准对分离菌株 NS01 药物敏感性进行评定。
2.4 16S rRNA 和 secA1 基因序列测序分析
2 结果
以分离菌株基因组为模板，采用 16S rRNA
基因和 secA1 基因引物分别扩增出 1 387 bp 和 459 bp
2.1 病原检测结果
的特异性条带，测序后以 BLAST 在线分析工具进
发病大口黑鲈体表溃疡出血，剖检可见肝脏、 行比对分析。从 GenBank 数据库中选取部分诺卡

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