Page 208 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 水 产 学 报 50 卷

(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani) 对 分 离 菌 株 注射；实验过程中，水温为 25 ℃~28 ℃，自然光
NS01 与其他 24 株鰤诺卡氏菌进行 ANI 计算 [22] ， 照；每日记录大口黑鲈的发病症状与死亡率，连
利用 R package 统计分析和图片绘制 (https://www.r- 续 观 察 14 d； 根 据 寇 氏 法 计 算 其 半 致 死 浓 度
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project.org/) 来分析分离菌株 NS01 与其他鰤诺卡 (LD )；无菌采集 1.8×10 CFU/mL 组实验鱼的肝
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氏菌之间的相似性和进化距离。 脏、脾脏、中肾组织并称重，每个组织加入 PBS
基于直系同源基因 (Orthogroups) 分析进化 研磨，稀释涂布于 BHI 固体平板上，统计活菌数，
发育树的构建 为了分析鰤诺卡氏菌之间的正 计算每个脏器的载菌量，重复 3 次。利用 SPSS
交群和直系同源物，推断出所有正交群的根基因 和 GraphPad Prism 8.0 软件分别进行显著性差异分
树，并识别基因树中的所有基因重复事件，使用 析及柱状图制作。实验鱼感染 7 d 后，取实验鱼
OrthoFinder v2.2.7 将分离菌株 NS01 的蛋白质序列 的肝脏、脾脏、中肾组织，同时采集对照组的相
与其他 24 株鰤诺卡氏菌的蛋白质序列进行比对 ， 应组织，放入 4% 多聚甲醛固定，样本送至武汉
[23]
分析结果以 Interactive Tree Of Life (iTOL) (https:// 赛维尔生物科技有限公司制作病理切片，光学显
itol.embl.de/) 用于绘制发育树，以 R package 用于 微镜观察病理变化并拍照。
[24]
统计分析和图片绘制 (https://www.r-project.org/)。 毒力基因检测 参考罗愿 、吕丽丽等 [25]
报道的鰤诺卡氏菌毒力基因引物，PCR 扩增检测
1.8 分离菌株致病性分析
分 离 菌 株 的 主 要 毒 力 基 因 ， 包 括 kasA、 kasB、
回归感染实验 选取健康大口黑鲈随机分 fbpA、 fbpC、 whiB3、 mce 1A、 mig、 pup、 mpa、
为 4 组，各组 15 尾，3 个感染组，1 个对照组； pafA、dop、gapA、ibeA 和 mip 等 14 种毒力基因
取分离菌株培养 5 d 菌体，用无菌 PBS 分别将其 (表 3)。反应体系 (20 μL)：模板 1 μL、2×Taq PCR
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稀释至 1.8×10 、1.8×10 、1.8×10 CFU/mL 3 个浓 Master Mix 酶 10 μL、上下游引物 (10 μmol/L) 各
度；腹腔注射 0.1 mL/尾，对照组用等量无菌 PBS 0.5 μL、ddH O 8 μL；扩增条件：预变性 95 ℃
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表 3 鰤诺卡氏菌毒力基因引物序列
Tab. 3 Primers sequences of virulence gene associated with N. seriolae
基因 引物序列 (5’→3’) 长度/ bp
gene primer sequence (5’→3’) length
kasA F: CGGAGGAGCACGCCAAAG 286
R: TGGCCCAGCGCAGACTTC
kasB F: GACATCGCGGGTCGCGAGGCATATGGTGGGGGT 1 347
R: CTGTCGCGTAGAGCTCGGGTTTAGTACCG
fbpA F: CGGGATCCATGCAGCTTGTTGACAGGGTT 1 109
R: TTGCGGCCGCCTAGGCGCCCTGGGG
fbpC F: CGCGGATCCATCGTGCGGCAGATGAGA 1 093
R: CCGGAATTCATGCTGGCTTGCTGGCT
whiB3 F: CCGGATCCAGCTGCAGAATGCCACAGCCGGAGCAGC 1 152
R: GTTAACTACGTCGACATCTTAAGCTGTGCGGCGGATG
mce 1A F: ATGGTGCAACAACACAGCGATGTGG 1 254
R: GCTTGTTGCCCCCCGCCAGTCCGGGC
mig F: CGATGGATCCCCCGATCGACGCGCCGCT 1 000
R: CGATGGATCCTCGATGGCCGCGACCAAC
pup F: CATAAGCTTATGGCGCAAGAGCAGACCAAGCG 213
R: TGAGAATTCTCACTGTCCGCCCTTTTGGACGT
mpa F: CATGAATTCATGGGTGAGTCAGAGCGTTCTCAGG 1848
R: TAGAAGCTTCTACAGGTACTGGCCGAGGTTGGAC
pafA F: CACGAATTCGTGCAGCGTCGAATCATGGGCATC 1 377
R: TAGAAGCTTCTACATGCTCGCGATCAGCCGCTT
dop F: CCCGAATTCATGTTCTGGGTCGGCGGGCCTT 1 683
R: TAAAAGCTTTTAGCGAGGCTCAGCGGTCAGT
gapA F: GTGACTGTCCGGGTAGGGAT 987
R: TTAGGCGAGACGGTTGGAGTAGC
ibeA F: ATGGGGGTGTTCTGTGGCATG 1 194
R: TCAGATCCGGTACCAGGTCGATT
mip F: ATGAGCAGCAAGCCGG 363
R: CGACCTGCAGGACTTGACT

https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
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