Page 207 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 覃晓曼，等：基于全基因组测序分析大口黑鲈鰤诺卡氏菌致病性和耐药性 50 卷

表 1 PCR 鉴定常见水产病原的引物序列
Tab. 1 Primer sequences of common aquatic pathogens for PCR identification
病原菌 引物序列 (5’→3’) 长度/ bp
pathogenic bacteria primer sequence (5’→3’) length
类志贺邻单胞菌 Plesiomonas Shigelloides F: CTGTCGTTCCTGAACTCTGGCGTGT 537
R: GACCACAATTTTGGCGTCGTTCGGG
维氏气单胞菌 A. veronii F: AGAGCGATCTGCTGGCCTGGTG 523
R: CGCAGGGCGTTGGTCTCGAT
嗜水气单胞菌 A. hydrophila F: CCTGATCGGGGCGGTCGACAACAAC 462
R: CTGCCGACGCTGGAGTAGGAGGAAC
温和气单胞菌 A. sobria F: CCACTATGTAGAGTTCGGAAAGAGC 457
R: GGAACGACGCCTATCAGGAA
鰤诺卡氏菌 N. seriolae F: TTTGAGAACTGCACAGTGGACGCGA 351
R: CCCGGCTACGCAACGACTGCCGTCT

1.4 病原菌形态观察 司测序，测序结果提交至 GenBank 数据库并获取
登 录 号 ， 利 用 National Center for Biotechnology
用 BHI 固体培养基和 BHI 液体培养基分别接
Information (NCBI) 网站中的 BLAST 进行比对分
种分离菌株，置于 28 ℃ 恒温培养 5 d，观察菌落
析，下载亲缘关系相近的菌株，利用 MEGA (11.0)
颜色、形态及菌液浑浊情况。同时对分离菌株的
软件中的 Neighbor-Joining 方法构建系统进化树。
纯培养物进行革兰氏染色与镜检观察。
取 1 mL 分离菌株的纯培养物置于离心管 1.6 全基因组测序
中，5 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液；将细菌 将−80 ℃ 保存的分离菌株 NS01 鉴定增殖后
样 本 用 无 菌 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 (PBS) 重 悬 洗 涤 ， 接种于 100 mL BHI 培养基 28 ℃ 培养 5 d 后，将

5 000 r/min 离心 5 min，重复洗涤 3 次；弃去上清 菌液 12 000 r/min 离心 5 min 收集菌体，送往上海
液，加入 2.5% 戊二酸固定液重悬，在室温下固 美吉生物医药科技有限公司完成分离菌株全基因
定 10 min，用铜网吸附细菌，室温静置过夜；将 组测序。细菌基因组测序采用二代+三代即 Illu-
铜网与导电胶黏在一起，干燥至临界点后进行真 mina+PacBio 的方式。运用统计学方法对所有测序
空喷涂，扫描电镜观察分离菌株的形态、大小、 读序 (reads) 的每个 cycle 进行碱基分布和质量波
排列方式及结构。 动的统计，并对每个样本的碱基质量、碱基错误

1.5 16S rRNA 和 secA1 基因序列测序分析 率以及碱基分布进行分析。利用软件 unicycler 进
行三代序列组装，借助 pilonjin 软件进行序列校正，
参考 Borrell 等 [20] 和 Conville 等 [21] 方法，合
如果最终组装序列两端存在一定长度以上的 over-
成 16S rRNA 基因通用引物和 secA1 基因引物 (表 2)，
lap，则将序列成环并截去其中一端 overlap 序列，
以细菌基因组 DNA 提取试剂盒提取的分离菌株基
最终得到完整的染色体及质粒序列。
因组 DNA 为模板。反应体系 (50 μL)：模板 1 μL、
1.7 全基因组比较基因组学分析
2×Taq PCR Master Mix 酶 25 μL、上下游引物 (10
μmol/L) 各 1.5 μL、ddH O 21 μL；扩增条件：预变 平均核苷酸多态性 (Average nucleotide iden-
2
性 95 ℃ 3 min，95 ℃ 变性 10 s，55 ℃ 退火 10 s， tity, ANI) 分析 从 NCBI 数据库 (https://www.
72 ℃ 延伸 2 min，30 个循环，72 ℃ 延伸10 min。 ncbi.nlm.nih.gov/) 中选取已知全基因组序列的其
PCR 扩增产物送生工生物工程 (上海) 股份有限公 他 24 株 鰤 诺 卡 氏 菌 ， 使 用 软 件 EzBioCloud

表 2 鰤诺卡氏菌 16S rRNA 和 secA1 基因扩增相关信息
Tab. 2 Amplification information of 16S rRNA and secA1 genes of N. seriolae
基因 引物序列 (5’→3’) 长度/ bp
gene primer sequence (5’→3’) length
16S rRNA F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1 400
R: ACGGCTACCTTGTTACGACTT
secA1 F: GTAAAACGACGGCCAGGACAGGAGTGGATGGGYCGSGTGCACCG 459
R: CAGGAAACAGCTATGACGCGGACGATGTAGTCCTTGTC

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
3