Page 107 - 《水产学报》2025年第11期

夏宁，等 水产学报, 2025, 49(11): 119409

5 min 充分裂解。95 ℃ 反应 8~15 min，冰浴 0.1% 三氟乙酸) 复溶冻干粉末，通过 HILIC 柱，
2 min，于 4 ℃、12 000 × g 离心 15 min，取上 使用 80 μL 0.5% FA 洗脱 3 次，80 μL 5% 乙腈与
清液加入足量 0.01 mol/L 碘乙酰胺溶液 (IAM, 0.5% FA 混合液洗脱 1 次，收集洗脱液并冻干。
Sigma, 美国)，避光反应 1 h。加入 4 倍体积的
1.5 液相质谱检测
−20 ℃ 预冷的丙酮于−20 ℃ 条件下沉淀至少 2 h，
泛素化和磷酸化修饰的检测使用 Q Exact-
于 4 ℃、12 000 × g 离心 15 min，收集沉淀。加
TM
入 1 mL −20 ℃ 预冷丙酮重悬并清洗沉淀，收集 ive HF-X 质谱仪 (Thermo, 美国) 进行液质检测，
糖 基 化 检 测 使 用 Thermo fisher HFX 质 谱 仪
沉淀，风干后即获得总蛋白。加入适量 Dis-
(Thermo, 美国) 进行液质检测。一级质谱分辨
solved Buffer 溶解蛋白沉淀。按照 Bradford 蛋
率 m/z 120 000 (m/z 200)，最大注入时间为 50
白质定量试剂盒计算待测样品的蛋白浓度。取
ms，扫描范围 300~1 400；二级质谱采用 Orbit-
20 µg 蛋白待测样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳
rap 检测，分辨率设为 15 000 (m/z 200)，最大离
(SDS-PAGE)，电泳结束后经考马斯亮蓝 R-250
子注入时间为 22 ms，HCD 相对碰撞能量为
染色，脱色并观察。
35%，数据采集时采用 18 s 动态排除。流动相
1.4 蛋白酶解修饰多肽富集 A 为 0.1% 甲酸，流动相 B 为 80% 乙腈及 0.1%
取 5 mg 蛋白样品，加入蛋白溶解液补足体 甲酸，液相色谱洗脱条件见表 1。

积至 1 mL，加入 50 μg 胰酶和 10 mL 0.05 mol/L
表 1 液相色谱洗脱梯度
三乙基碳酸氢铵 (TEAB, Sigma, 美国) 缓冲液，
Tab. 1 Liquid chromatography elution gradient
混匀后于 37 ℃ 孵育 4 h，再加入 50 μg 胰酶和
时间/min 流速/(nL/min) 流动相A/% 流动相B/%
CaCl 酶切过夜。加入甲酸调节 pH 小于 3，混 time flow velocity mobile phase A mobile phase B
2
匀后于室温、12 000 × g 离心 5 min，取上清液 0 600 88~94 6~12
缓慢通过 C 除盐柱，之后使用 0.1% 甲酸与 3% 8 600 70~88 12~30
8
1
乙腈混合清洗液连续清洗 3 次，再加入适量洗 58 600 60~70 30~40
脱液 (0.1% 甲酸、70% 乙腈)，收集滤液并冻干， 70 600 5~60 40~95
获得冻干粉末用于修饰多肽富集。 71 600 5 95
泛素化多肽富集 加入适量 MOPS IAP 78 600 5 95
溶 液 (0.05 mol/L MOPS、 0.01 mol/L KH PO 、
2 4
0.05 mol/L NaCl) 溶解冻干粉末，12 000 × g 离心 1.6 修饰蛋白鉴定、定量与功能分析
5 min，取上清液加入预冷 PBS 清洗后的 anti-
基于质谱检测得到的总蛋白质组和修饰组
PTM-Agarose 微珠，4 ℃ 垂直旋转孵育约 2 h， 的原始文件，使用 Proteome Discoverer 2.5 软件
之后 4 ℃、2 000×g 离心 30 s，取上清液保存， 对具有泛素化和磷酸化修饰位点的肽段数据进
微珠中加入预冷的 MOPS IAP 溶液和水各连续 行检索，使用 pGlyco 3.0 软件对具有糖基化修
清洗 3 次，4 ℃、3 000×g 离心 30 s。加入洗脱 饰位点的肽段数据进行检索，检索数据库为
液 (0.15% TFA)，颠倒混匀后室温放置 10 min， grass_carp. pep. fasta (30 098 条序列) (NCBI 登录
2 000×g 离心 30 s，重复洗脱 2 次，洗脱样液合并 号 ： PRJNA745929) 。 筛 选 并 保 留 可 信 度 在
[18]
后 5 000×g 离心 5 min，取上清液进行除盐后冻干。 99% 以上的谱肽肽段匹配图谱 (peptide spectrum
磷酸化修饰多肽富集 加入 binding buf- matches, PSMs)，至少包含 1 个 unique 肽段的蛋
fer 溶解冻干粉末，4 °C、12 000×g 离心 5 min， 白为可信蛋白，去除假阳性率 (FDR) 大于 1%
取上清液加入 binding buffer 预处理后的 IMAC- 的肽段和蛋白。前体离子的质量容差为 10 ppm
Fe 柱，室温孵育 30 min，2 000×g 离心 30 s 后 (parts per million)，碎片离子的质量容差为 20
加入清洗液和水各清洗 1 次，2 000×g 离心 30 s， ppm。固定化修饰为半胱氨酸的烷基化修饰，
弃去接液管，更换新的离心管，加入洗脱液， 可变修饰为甲硫氨酸氧化等修饰，N 端为乙酰
收集多肽洗脱液，冻干。 化等修饰，允许最多 2 个漏切位点。采用 label-
糖基化糖肽富集 用 80% 的乙腈 (内含 free 基于母离子信号强度对蛋白定量，蛋白质

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