Page 106 - 《水产学报》2025年第11期
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夏宁，等                                                                 水产学报, 2025, 49(11): 119409

                                     [5]
              和 鞘 磷 脂 等 含 量 增 加 。 暴 露 于 登 革 病 毒                酸化蛋白与脂质代谢相关。这表明泛素化与磷
              (dengue virus) 后的人血小板和单核细胞会形成                    酸化修饰参与了         poly(I:C) 诱导巨噬细胞脂质代
              聚集体并增加胞内脂滴累积 。甲型流感病毒                             谢变化的过程，强调了蛋白修饰在                  dsRNA  病毒
                                         [6]
              (influenza A virus) 对脂肪酸、胆固醇、磷脂和                 入侵中的重要性，同时，鉴定出的上述                    16  个蛋
                                              [7]
              参与脂滴形成的糖脂代谢产生影响 。                                白为未来     dsRNA  病毒的防治提供了候选靶点。
                   关于病毒可以调控脂质代谢及脂滴形成的
                                                                1    材料与方法
              研究已有广泛报道，但其调控机制仍处于探索
              中。病毒可以直接诱导宿主脂质代谢相关蛋白
                                                                1.1    草鱼头肾巨噬细胞分离和培养
              表达。冠状病毒          (coronavirus) 感染人外周血单
              核 细 胞 后 直 接 诱 导     CD36、 SREBP-1、 PPARγ             本实验所用草鱼          (Ctenopharyngodon idella)
              和  DGAT1  等蛋白表达，进而增强脂肪酸合成                        均购自湖北黄冈草鱼养殖场，体重 (500 ± 25) g，
              基因   SREBP-2  表达上调。病毒自身基因组的复                     均健壮活泼，无明显伤病。实验开展前，所有
              制也影响着脂质代谢。丙型肝炎病毒                     (hepatitis  实验鱼在华中农业大学水产学院水产养殖基地
              C virus) 非结构蛋白      NS5A  的结构域Ⅱ通过与               室内鱼缸暂养       2  周，并在实验开始前          2  天停止
              Rab18  的相互作用与脂滴不可逆结合，从而允                         投喂。草鱼头肾巨噬细胞通过                percoll 密度梯度
              许该病毒蛋白运输到脂滴，并影响脂质代谢调                             离心方法进行分离           [17] 。实验鱼通过     150 mg/L
              节  [8-9] 。此外，病毒通过破坏脂质运输途径影响                      MS-222  深度麻醉，无菌取出草鱼头肾并于                  100
              脂质代谢。柯萨奇病毒            B3(coxsackievirus B3) 被    μm  筛网进行研磨，使用磷酸盐缓冲溶液                   (PBS)
              报道利用网格蛋白介导的内吞作用将质膜及胞                             稀释。获得的头肾组织研磨液经                  34/51%  密度
              外介质中胆固醇劫持并运输至病毒复制细胞器                             的  percoll（Pharmacia, 瑞典）进行梯度离心，白
              中 。靶向病毒调控脂代谢的通路可以有效治                             细胞层被吸取后经过贴壁黏附，以获得较纯的
                 [10]
              疗病毒造成的机体损伤，例如机体被                      SARS-      草鱼巨噬细胞。巨噬细胞在             L-15  培养基中培养，
              CoV-2  病毒感染后，通过向细胞培养基中添加                         培养基中添加        10% 胎牛血清      (FBS，Gibco, 美
              脂蛋白脂肪酶和脂肪酸合成酶抑制剂奥利司他                             国) 和  200 IU/mL  青霉素-链霉素      (Sigma, 美国)。
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              (orlistat)，抑制甘油三酯的合成与分解，从而达                      细胞培养于      28 °C，5% CO 的培养箱中。本研
              到有效降低       HEK-293T-ACE2   细胞上清中病毒              究获得了华中农业大学实验动物管理和使用伦
              的滴度    [11-12] 。                                 理委员会批准        (HZAUFI-2021-0035)，实验过程
                   关于蛋白的修饰是否参与病毒调控脂质代                          中操作人员严格遵守华中农业大学实验动物中
              谢过程，目前知之甚少。研究显示，蛋白的修                             心伦理规范，并按照华中农业大学实验动物伦
              饰在脂质代谢过程中不可或缺，机体通过诱导                             理委员会制定的规章制度执行。
              脂质分解蛋白和载脂蛋白泛素化来调节脂质代谢和                            1.2    待测细胞样品制备
              运输   [13-14] ；脂滴储存蛋白磷酸化后快速参与脂
                                                                                              6
                                                                   调整巨噬细胞密度为            1 × 10  个/mL，PBS
                            [15]
              质的分解代谢 ；N-糖基化是维持脂质稳态所
                                                               清洗  3  次后，更换无抗无血清           L-15  培养基进行
              必需的 。最近的研究同样发现，作为一种双
                     [16]
                                                               培养。巨噬细胞稳定后，刺激组添加                   50 μg/mL
              链  RNA (dsRNA) 病毒，GCRV       可以诱导单核巨
                                                               poly(I:C)，对照组加入等量        PBS，孵育     2 h  后迅
              噬细胞内脂滴的大量累积 。因此，研究泛素
                                       [17]
                                                               速放置冰上。使用预冷            PBS  清洗  3  次，收取细
              化、磷酸化以及糖基化是否参与病毒调控脂质
                                                               胞样并放置于−80 ℃        冻存。
              代谢的过程，对未来靶向蛋白修饰通路设计抗
                                                                1.3    总蛋白提取及质检
              病毒药物具有重要意义。
                   本研究通过       dsRNA  类似物    poly(I:C) 刺激          细胞样品解冻后超滤浓缩，−80℃                 冷冻后
              草鱼头肾巨噬细胞以模拟              dsRNA  病毒感染。泛           低温研磨成粉，随后迅速转移至液氮预冷的离
              素化、磷酸化以及糖基化              3  种蛋白质谱及修饰             心管内，加入适量的            SDT (含  0.1 mol/L NaCl)
              组学技术分析表明，15            个泛素化蛋白和        1  个磷      和  100 × DTT  进行溶解，振荡混匀，冰水浴超声

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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