Page 103 - 《水产学报》2025年第10期

陈辉，等 水产学报, 2025, 49(10): 109608

尾刀替换 TA 25/1000 圆柱形探头，测试类型为 用于评估 RNA 的纯度，当获取的 A 260 /A 28 0 比值
下压，目标模式为距离，目标值 25.00 mm，测 在 1.8~2.1 时，表明该 RNA 纯度较好，之后记
试速度为 1.00 mm/s。 录好各样本 RNA 浓度以便进行后续的实验。以

持水率测定 称取吉富罗非鱼背部肌肉 上所有操作均在冰上进行。对上述步骤获取的
样品 (约 1~2 g) 并把肌肉样品放在 1 张定性滤纸 总 RNA 使用 TaKaRa 的反转录试剂盒进行反转
上，接着再拿 1 张定性滤纸放置在肌肉正上方， 录获得 cDNA，该试剂盒为两步法获得纯的
然后隔着滤纸将 1 个重 1 kg 的砝码正中压在上 cDNA，分别为基因组 DNA 的去除和 RNA 的
面，持续 5 min，最后将肌肉取出称其质量。 反转录过程，以上所有操作均在冰面进行。具
持水率计算公式： 体步骤参加试剂盒说明书。随后用 SYBR Green
®
持水率 (%) = (压前肌肉质量 − 压后肌肉质量)/ Master Mix 试剂 [ 东洋纺 (上海) 生物科技有限
压前肌肉质量×100% 公司 ] 对获取的 cDNA 进行荧光定量扩增目的

熟肉率测定 称取吉富罗非鱼背部肌肉 基因片段，测定的仪器为 Bio-Rad CFX Maestro
样品 (约 1~2 g) 并记录重量，然后将鱼肉块放入 荧光定量仪，内参基因为 β-actin，每个样品设
沸腾的水中，5 min 后，将肌肉取出放于滤纸上 置 2 个重复。所设计引物在考虑 NCBI 所提供
冷却，之后再称取质量。 的基因组信息及遵循合适的引物设计原则的前
熟肉率计算公式： 提下经过 Primer Premer 5 软件进行了设计，引
熟肉率 (%) =煮后肌肉质量/煮前肌肉质 物的实际合成工作则由生工生物工程 (上海) 股
量×100% 份有限公司负责完成 (表 3)。反应程序分为实时

脂肪酸测定 采用经典的氯仿—甲醇法 荧光定量 PCR 过程和熔解曲线两个过程，其中
(体积比为 2∶1) 提取样品中的总脂质。脂肪酸 荧光定量 PCR 反应程序为 95 °C 30 s；95 °C 5 s,
甲酯化的制备使用 0.5 mol/L KOH 的甲醇溶液 60 °C 30 s, 72 °C 60 s, 40 个循环；72 °C 60 s；熔
和 50% 三氟化硼的甲醇溶液将总脂质样品转化 解曲线过程为 65 °C 5 s，1 个循环，95 °C 1 s，
为脂肪酸甲酯 (FAMES)。FAME 检测使用带有 1 个循环。各基因扩增效率在 90%~105%，各基
氢-火焰离子化检测器安捷伦气相色谱仪 (GC; 因的相关系数大于 0.98。通过计算 2 −∆∆C t 值测定
Model 7890B, Agilent Technologies, Palo Alto, 美 靶基因相对表达量。

国)。GC 配备毛细管柱 (60 m×0.25 mm CP7487，
1.5 数据统计及分析
0.20 μm 膜厚度；Agilent，美国)。脂肪酸的鉴
定根据 37 种脂肪酸标准品来确定 (Sigma-Ald- 所有数据均表示为平均值±标准误 (mean±
rich, St. Louis, MO, 美国)，饲料、肌肉和全鱼脂 SE)，并通过 SPSS 26.0 软件进行统计分析。采
肪酸，采用面积归一法计算各种脂肪酸所占的 用 ANOVA 进行方差，若组间差异显著，则用
百分比，结果表示为总脂肪酸的百分比。 Duncan's 比较，并用肩标不同字母标出，差异

肝脏 HUFA 合成相关基因表达量测定 使 显 著 性 均 以 P<0.05 为 准 。 所 有 表 格 均 采 用
用 TRIzol 试剂 [ 宝生物工程 (大连) 有限公司 ] office 软件绘制。所有图均采用 Graphpad Prism
按照测定说明书从肝脏样本中提取总 RNA，用 8 制作，柱子上标的字母不同代表存在显著性
分光光度计对总 RNA 的 A 260 /A 28 0 比值进行检测， 差异。

表 3 引物信息表
Tab. 3 Primers used for gene expression in this study
基因名称 gene name 正向引物 forward primer(5′-3′) 反向引物 reverse primer(5′-3′) 登录号 accession no.
β-actin CAGGATGCAGAAGGAGATCACA CGATCCAGACGGAGTATTTACG KJ126772.1
Δ4fads2 CTTACTGTGCTCGGTGATT GGTCCTTGCTGAAGATGTT XM_005453697.4
Δ5Δ6fads2 CTGGTCATCGATCGAAAGGT GCGGCTTCAGAAACTTATGC NM_001279623.1
elovl5 GGCTTCCTCCTCCGTCTAAA GTGCAAAGGTTGGTGGGTAG XM_003440552
注：Δ4fads2、Δ5Δ6fads2. 脂肪酸去饱和酶； elovl5. 长链脂肪酸延长酶。
Notes: Δ4fads2, Δ5Δ6fads2. fatty acid desaturase; elovl5. long-chain fatty acid elongase.

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