Page 112 - 《中国医疗器械杂志》2025年第6期

Chinese Journal of Medical Instrumentation 2025年 第49卷 第6期

监 管 与 测 试

式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾问 2.2.2 酶解法处理方法
1）对照品溶液制备：按照重组人源化胶
题。三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200 nm，对在 （
214 nm处的蛋白检测干扰很小。添加在流动相中的 原蛋白敷料的制备方法，分别制得蛋白浓度为
三氟乙酸体积浓度一般为 0.1%，在这个浓度下， 0、0.05、0.1、0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL的敷
大部分反相色谱柱都可以产生良好的峰形，当三氟 料，精密称取各蛋白浓度的敷料5.0 g，分别置于
乙酸浓度远远低于这个水平时，峰的展宽和拖尾就 称量瓶中，加透明质酸钠酶200 μL，摇匀，放置
变得十分明显，故选用体积浓度为0.1%的三氟乙 在5 ℃条件下充分反应，即得对应浓度的对照品
酸作为流动相。 溶液。
2.1.4 流动相色谱条件 （ 2）供试品溶液制备：精密称取敷料（蛋白
色谱柱（Agilent Eclipse XDB-C18, 4.6×150 mm, 浓度为0.1 mg/mL）5.0 g，置于称量瓶中，加透明
5 μm）；流动相：A相（体积浓度为0.1%的TFA水 质酸钠酶200 μL，摇匀，放置在5 ℃条件下充分反
溶液）与B相（体积浓度为0.1%的TFA乙腈溶液）， 应，即得对应浓度的供试品溶液。
梯度洗脱（见表1）；流速：1.0 mL/min；进样量： （ 3）空白溶液制备：精密称取敷料（蛋白浓
10 μL或20 μL；柱温：30 ℃；检测波长：214 nm。 度为0 mg/mL）5.0 g，置于称量瓶中，加透明质酸

表1 梯度洗脱程序 钠酶200 μL，摇匀，放置在5 ℃条件下充分反应，
Tab.1 Gradient elution procedure
即得空白溶液。
时间/min A相体积分数(%) B相体积分数(%)
0 95 5 3 结果与讨论
3 95 5
6 88 12 3.1 敷料处理方法研究
8 87 13 在重组人源化胶原蛋白敷料中加入酸、碱或对其
9 85 15 进行加热处理，破坏其黏度，确保样品可以进行液
14 80 20 相检测。观察发现高浓度碱、酸（浓度为1.0 mol/L）
20 75 25
会破坏敷料黏度使其变稀，同时加酸的变化不如
22 74.5 25.5
加碱明显，敷料仍有一点稠度，但对蛋白的破坏比
27 70 30
较大，不宜进行液相检测。低浓度碱、酸（浓度为
29 95 5
0.1 mol/L）虽然对蛋白破坏小，但敷料黏度大，再
30 95 5
对其进行稀释后，含量低于检出限，不能准确测

2.2 样品处理方法 量。同时对敷料水浴60 ℃，发现这会使敷料变
重组人源化胶原蛋白敷料以重组Ⅲ型人源化胶 稀，而不加热未能破坏敷料黏度。考虑色谱柱在
原蛋白冻干纤维为主要原料，辅以质量浓度为 pH值为6~9 时有良好的稳定性，故先取2.2.1项下浓
0.9%的透明质酸钠和PBS缓冲液，经过无菌加工过 度为1.0 mg/mL的蛋白溶液，加碱、加热处理后进
程控制，制得的凝胶型敷料具有一定的黏度，需要 行液相考察（见图2a、图2d、图2c所示），结果这
进行适当的前处理后再进行液相检测。 两种处理方式均破坏蛋白，故对于蛋白含量较大的
2.2.1 稀释法处理方法 敷料采用稀释法进行前处理。
（ 1）对照品溶液制备：取重组Ⅲ型人源化胶原 对含不同胶原蛋白浓度敷料进行不同倍数的稀
蛋白冻干纤维，加入适量水溶解并稀释，制得浓度为 释，可发现胶原蛋白浓度为1.0 mg/mL的敷料稀释
0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL的对照品溶液。 4倍后，黏度降低，且蛋白含量在稀释4倍后可以检
2）供试品溶液制备：精密称取敷料（蛋白
（ 测到。稀释倍数小于3倍，敷料样品比较黏稠，不
浓度为1.0 mg/mL）2.5 g于称量瓶中，加水定量至 容易通过0.22 μm滤膜；稀释倍数高于4倍，则含量
10 mL，即得供试品溶液。 会过低，影响检测结果。
（ 对于胶原蛋白浓度低的敷料，不适合用稀释法处
3）空白溶液制备：精密称取敷料（蛋白
浓度为0 mg/mL） 2.5 g于称量瓶中，加水定量至 理，可以采取酶解法，酶具有专一性，透明质酸钠酶
10 mL，即得空白溶液。 为一种能水解透明质酸的酶，使敷料的黏度降低。

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