Page 68 - 《中国药科大学学报》2026年第1期
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                1.2    仪 器                                      培养，分别在      24，48，72，96 h 用  CCK-8 试剂盒检测
                    MQX200 全波长自动酶标仪（美国             Bio-Tek 公    细胞增殖能力。转染后            48 h 提取细胞总蛋白，进
               司）；显微镜（日本奥林巴斯            Olympus 公司）；PCR   扩     行  Western blot 检测。
               增仪（美国     Thermo 公司）；凝胶成像曝光仪（上海天                  2.3    ISM1 过表达稳转细胞株的构建
               能科技有限公司）。                                             用定制的     ISM1 过表达慢病毒和对照慢病毒
                1.3    细胞株和质粒                                   感染   A549 和  H1299 细胞（感染复数为         10）。慢病
                    人非小细胞肺癌细胞株            A549 和  H1299 购自      毒感染    48 h 后，用   1.0 μg/mL  嘌呤霉素筛选      14 d，
               美国   ATCC  库，用含有    10%  胎牛血清的      RPMI-1640    获得   ISM1 稳定过表达的细胞株和对照细胞株。
               培养基，于     5%  二氧化碳的     37℃  细胞培养箱中培养。            2.4    细胞增殖检测
                    ISM1 过表达质粒由本课题组构建                [15] ，即在        将细胞接种于       96 孔板，给予不同浓度          rISM1
               pcDNA3.1 载体中插入人        ISM1 基因编码序列。              处理   24，48，72 h，进行细胞增殖检测。将上述转染
                1.4    组织标本                                     了质粒的细胞，以及稳转细胞株接种于                  96 孔板，分
                    人  NSCLC  组织和正常肺组织标本取自            2023—     别于   24，48，72 h 进行细胞增殖检测。具体操作是
               2024 年河南科技大学第一附属医院手术切除病                          在实验结束前       2 h，加入含    10% CCK-8 的完全培养
               例。其中      48 例  NSCLC  患者年龄     43~69 岁（男性       基孵育    2 h。用酶标仪在       450 nm  波长处检测吸收
               25 例，女性    23 例）；同时收集      20 例同期手术切除            度。细胞增殖能力用不同时间点的吸收度除以
               的  NSCLC  周围正常肺组织作为正常组织。所有涉                      0 h 的吸收度，计算细胞增殖倍数，并进行统计分析。
               及人体样本的研究均经河南科技大学第一附属医                             2.5    转录组测序和    qRT-PCR  检测
               院伦理委员会批准，符合《赫尔辛基宣言》，并获得                               H1299 细胞给予    rISM1（1 μg/mL）处理    24 h 后，
               了所有参与者的知情同意。所有实验均按照批准                            提取细胞总      RNA，由杭州联川生物技术股份有限公
               的指导方针进行。                                         司进行转录组测序，以及差异基因的富集分析。
                                                                     H1299 和  A549 细胞给予     rISM1（1 μg/mL）处
                2    方 法
                                                                理  24 h 后，提取细胞总      RNA，测定浓度后，取         RNA
                2.1    肺组织病理切片免疫组织化学染色                          1.0 μg 用  Hiscript Ⅲ qRT SuperMix 试剂盒逆转录
                    肺组织用     4%  多聚甲醛固定，石蜡包埋组织切                 为  cDNA。按    SYBR qPCR Master Mix 试剂盒说明
               片，脱蜡脱水。用        3%  过氧化氢室温处理         10 min 灭    书进行实时荧光定量          PCR  检测。反应程序如下：预
               活内源性过氧化物酶。用              10 mmol/L  柠檬酸缓冲        变性   95 ℃ 30 s；变性   95 ℃ 10 s，退火   60 ℃ 30 s，
               液高温高压处理         10 min 进行抗原修复。用含           5%    40 个循环。用 2     −ΔΔCt  法计算目的基因相对表达量。

               BSA  的  PBS  孵育  30 min 封闭非特异性抗原。用               引物序列参见表        1。
               抗  isthmin-1 的抗体在   4 ℃  孵育过夜。最后用二氨               2.6    ROS  和细胞凋亡检测
               基联苯胺（DAB）显色，并用苏木精乙醇溶液复染细                              用  rISM1（1 μg/mL）处理   A549 和  H1299 细胞
               胞核 ，显微镜下观察和拍摄图像。使用                   Image-pro   2 h，按照  ROS  检测试剂盒及       Caspase-3 活性检测试
                   [15]
               Plus 软件分析图像。                                     剂盒的说明书操作，用酶标仪读取吸收度，计算处
                2.2    ISM1 过表达质粒的转染                            理组与对照组的比值，进行统计分析。
                    细胞接种于      6 孔板，24 h 后按照    Lipofectamine    2.7    统计分析数据
               2000 转染试剂说明书转染           ISM1 过表达质粒或对                 ISM1 在  NSCLC  和癌旁正常肺组织中的表达
               照空载体。转染后         24 h 将细胞重新接种于         96 孔板     用阳性率表示，统计学分析采用卡方检验。定量

               Table 1    Primer sequences for qRT-PCR
                       Gene                  Forward primer (5'→3')               Reverse primer (5'→3')
                      FoxO1               TGGACATGCTCAGCAGACATC                TTGGGTCAGGCGGTTCA
                      FoxO3               CGGACAAACGGCTCACTCT                  GGACCCGCATGAATCGACTAT
                      GAPDH               ATGGGGAAGGTGAAGGTCG                  GGGGTCATTGATGGCAACAATA
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