Page 54 - 《中国药科大学学报》2025年第5期

586 学报 Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 583 − 591 第 56 卷

去未黏附的细胞，用 5% 多聚甲醛固定 30 min，加入 离心 30 min，弃去上清液，75% 乙醇洗涤沉淀 2 次，
结晶紫室温染色 15 min。洗涤小室后晾干，用湿润 晾干后用 DEPC 水溶解备用。
的棉签擦去小室上层未穿过的细胞，置于显微镜下 2.9 放线菌素 D 实验检测 mRNA 稳定性
拍摄。 在细胞完全培养基中加入放线菌素 D 至终浓
2.7 基质胶细胞侵袭实验 度为 10 μmol/L，在转染过表达质粒 48 h 后给细胞
所使用的基质胶 Matrixgel（50 mg/L）提前 1 d 换液，再继续培养 0、3、6、9、10 h 后收取细胞提取
从−20 ℃ 取出至 4 ℃ 融化，将其与无血清的基础培 RNA 进行实时荧光定量 PCR，检测不同时间点
养基按照 1∶20 的比例稀释后使用，吸取 60 μL 均匀 ARMC9 的 mRNA 水平以计算其降解速率。
铺在小室上层，置于培养箱凝固 2 h。向 Transwell 2.10 统计学分析
小室上层加入基础培养基重悬的细胞悬液，下层孔 作图及统计分析使用 Graphpad Prism 10，采用
板加入完全培养基，继续培养 24 h 后取出，PBS 洗 独立样本 t 检验比较两组数据差异性，采用单因素
涤后使用 5% 多聚甲醛固定细胞 30 min，加入结晶 方差分析来分析 3 组以上数据差异性，利用平均
紫染色 15 min，洗涤后晾干小室，用湿润的棉签擦 值±标准差（ x± s）表示数据 P<0.05 表示差异具有显
去未穿过的细胞，置于显微镜下观察并拍摄。 著性。
2.8 甲基化 RNA 免疫沉淀（MeRIP）实验
3 结 果
将 Protein-A/G 磁珠混匀后吸取 35 μL，加入
PBS 洗涤后重悬于 PBS 1 mL 中，加入 m C 5 抗体 3.1 NSUN2 在胃癌患者及胃癌细胞中高表达
3 μg，4 ℃ 孵育过夜。提取细胞总 RNA，RNA 片段 在 TCGA 数据库中分析 NSUN2 基因在人胃
化操作后纯化并回收备用。将已结合抗体的磁珠 癌中的表达情况，结果显示胃癌组织中的 NSUN2
用洗涤缓冲液（150 mmol/L LiCl，10 mmol/L Tris， 转录本水平与正常组织相比显著上调（P<0.001，
0.5% NP-40，使用 DEPC 水配制）洗涤两次后，再使 图 1-A），且在不同时期均有显著性差异（P<0.001，
用洗涤缓冲液 1 mL 重悬磁珠，加入片段化的 RNA 图 1-B）。本研究也使用 Western blot 检测了胃黏膜
25 μg，4 ℃ 摇床旋转孵育 4 h。将孵育后的磁珠洗 上 皮 细 胞 GES-1 和 胃 癌 细 胞 系 AGS 的 NSUN2
涤 3 次，置于磁力架上分离回收磁珠，加入 RNAex 蛋白表达水平。结果显示，与胃黏膜上皮细胞系
500 μL,涡旋磁珠 30 s，加入氯仿 100 μL 颠倒混匀， GES-1 相比，除恶性程度较低的 AGS 细胞，HGC27、
4 ℃ 12 200 r/min 离心 15 min，吸取上清液 100 μL MKN28、MKN45 等胃癌细胞的 NSUN2 蛋白水平
至新离心管中，依次加入 5 mol/L 乙酸铵 33 μL、 均有不同程度的上调（图 1-C）。
7.5 mol/L LiCl 10 μL，线性化丙烯酰胺（5 mg/mL） 3.2 NSUN2 促进 AGS 细胞的增殖、迁移和侵袭
1 μL，置于−20 ℃ 冰箱静置 1 h。4 ℃ 12 200 r/min TCGA 数据库和蛋白免疫印迹实验结果显示，

A Expression of NSUN2 in STAD B Expression of NSUN2 in STAD based C

based on sample types on individual cancer stages
100 *** 100 *** *** *** GES-1 AGS HGC-27 MKN-28 MKN-45
Transcript per mlliion 60 Transcript per mlliion 60 *** NSUN2
80
80

40
40
20
0 20 0 β-Tubulin
Normal Primary tumor Normal Stage1 Stage2 Stage3 Stage4
(n=34) (n=415) (n=34) (n=18) (n=123)(n=169) (n=41)
TCGA samples TCGA samples

Figure 1 NOP2/Sun RNA methyltransferase 2（NSUN2）expression levels in gastric cancer
A: Expression levels of NSUN2 in gastric cancer and normal tissues (Database:TCGA); B: Expression levels of NSUN2 in different
cancer stages (Database:TCGA); C: NSUN2 protein expression in gastric cancer cell lines
***P<0.001