Page 53 - 《中国药科大学学报》2025年第5期
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第  56 卷第  5 期     李 越，等：NSUN2 通过介导      ARMC9 的  m C 5  修饰促进胃癌细胞的增殖、转移和侵袭                  585

               宁公司）；RIPA     细胞裂解液（北京索莱宝生物科技                     2.3    实时荧光定量    PCR
               有限公司）；m C    5  一抗（上海艾博抗贸易有限公司）；                      取出转染质粒后       48 h 的  AGS  细胞，使用  RNAex
               Tubulin 一抗、NSUN2 一抗、ARMC9 一抗（武汉三                 和氯仿提取细胞总         RNA ，逆转录操作得到          cDNA，
                                                                                     [17]
               鹰生物技术有限公司）；6 mol/L LiCl 溶液、HRP             标     与  SYBRGreen 混合均匀，进行实时荧光定量               PCR
               记山羊抗小鼠        IgG、HRP  标记山羊抗兔       IgG、小鼠       操作。反应结束后记录            Ct，按照   2 −ΔΔCt  方法计算基
               IgG（上海碧云天生物技术有限公司）；ECL                   曝光      因的相对表达量。所用引物序列见表                  1。

               液（合肥兰杰柯科技有限公司）；放线菌素                      D（美       Table 1    Primer sequences for real-time RT-PCR
               国  MCE  生物科技公司）；Next  Magnesium RNA
                                            ®
                                                                    Gene            Primer Sequence （5′→3′）
               Fragmentation Module 试剂盒（纽英伦生物技术有限                 GAPDH      Forward: CTGGGCTACACTGAGCACC
               公司）；其他试剂均为市售分析纯。                                              Reverse: AAGTGGTCGTTGAGGGCAAT
                1.2    仪 器                                        NSUN2      Forward: GAACTTGCCTGGCACACAAAT
                    Nanodrop 2000 分光光度计、低温高速离心机                              Reverse:TGCTAACAGCTTCTTGACGACTA
                                                                  ARMC9      Forward: AGTCCTTTCGGATCTTCTTGGC
               （ 美 国  Thermo  Fisher  Scientific 公 司 ） ； 荧 光 定 量
                                                                             Reverse: TCCATTCCCATTGCTCTTGCT
               PCR  仪（瑞士    Roche 集团）；蛋白电泳仪、转膜仪、
                                                                  Fragmented-  Forward: GAAGCTTCTGACCACGGAGT
               化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；酶标                            ARMC9
                                                                             Reverse: AGGTGTGTGTTGGTCTTCCA
               仪（美国    Biotek 公司）；倒置显微镜（日本           Olympus
               株式会社）。                                            2.4    蛋白免疫印迹实验（Western blot）
                1.3    细胞株                                           收取状态良好的胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞，
                    胃癌细胞     MKN28、MKN45（上海酶研生物科                使用   RIPA  裂解液提取细胞总蛋白，BCA            法测定样
               技有限公司）；胃黏膜上皮细胞               GES-1、胃癌细胞          品蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，混匀煮沸后备
               AGS、HGC27 均由南京医科大学附属南京市第一                        用。以    90 V  恒定电压电泳，250 mA        恒定电流转
               医院肿瘤科惠赠。所有细胞均已通过短串联重复                            90 min 后，取出    PVDF  膜置于使用       TBST  配制的
                                                                                          [18]
               序列检测（short tandem repeat，STR）分析鉴定。               5%  脱 脂 乳 粉 中 封 闭    1.5  h 。 将 所 需 抗 体 （ β-
                                                                Tubulin、 β-actin、 NSUN2、 ARMC9， 1∶8 000） 用
                2    方 法
                                                                TBST  稀释至推荐浓度用来孵育已封闭的                   PVDF
                2.1    基因表达情况与临床病理学特征关联分析                       膜 ， 摇 床 上   4  ℃  孵 育 过 夜 。 取 出   PVDF  膜 ， 用
                    使用   The Cancer Genome Atlas （TCGA）数据       TBST  清洗   10 min，重复  3 次。用    5%  脱脂乳粉稀
               库（https://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）分析评  释  HRP  标记山羊抗兔二抗（1∶10 000），室温孵育
               估  NSUN2 和   ARMC9 在不同病程分期胃癌组织，                  1 h，清洗   10 min，重复  3 次。置于化学发光成像仪
               以及胃癌和癌旁正常组织中的表达情况。                               曝光显影。
                2.2    细胞培养、质粒转染                                 2.5    集落形成实验
                    人胃癌细胞系        GES-1、MKN28 和    MKN45 均           取出消化后重悬，计数完毕的细胞悬液，分别
               培养于    RPMI 1640 培养基，人胃癌细胞系            AGS  培    向  6 孔细胞培养板中各孔接种            1×10  个细胞，加入
                                                                                                6
               养于   DMEM/F-12 培养基；人胃癌细胞系           HGC27 培      完全培养基放回培养箱。每              5 天取出，镜下观察细
               养于   MEM   培养基，所有培养基均添加              10% FBS，    胞情况，种板后        14 d，待肉眼可见已形成明显的克
               所有细胞均置于        37 ℃、5% CO 培养箱中培养。                隆集落时取出，每孔加入           5%  多聚甲醛固定，缓慢加
                                          2
                    选取状态较好的细胞，消化计数后取适量细胞                        入  0.5% 结晶紫溶液染色        20 min，PBS  多次洗涤直
               接种于    6 孔细胞培养板中，在细胞密度约               45%  时，    至背景清晰，拍照并记录克隆数量。
               使用聚乙烯亚胺（polyethylenimine）将过表达质粒                   2.6    Transwell 细胞迁移实验
               和其对应空载体质粒转染入细胞，分别于                     24 h 和         向每个   Transwell 小室上层加入基础培养基重
               48 h 采用  qRT-PCR  法和   Western blot 法检测其转        悬的细胞悬液，下层板孔中加入含血清的完全培
               染效率，再收集细胞进行后续实验。                                 养基，放回培养箱继续培养             24 h 后取出，用    PBS  洗
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