Page 104 - 《中国药科大学学报》2025年第5期
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636                      学报   Journal of China Pharmaceutical University 2025, 56(5): 634 − 644  第 56 卷

                1.2    仪 器                                      泡形态并统计正常与异常卵泡比例。另一侧卵巢
                    多功能酶标仪（杭州奥盛仪器有限公司）；生物                       保存于−80 ℃，用于蛋白组学和转录验证。
               显微镜（上海测维光电技术有限公司）；qPCR                  仪（杭       2.2    代谢组学分析
               州博日科技股份有限公司）；真空离心浓缩仪（北京                               以大鼠血清为对象，进行代谢组学分析。按
                                                                                              13
               吉艾姆科技有限公司）；ExionLC™ AD 高效液相色                     体积比    1∶4 加入含内标（4 μmol/L C-谷氨酰胺）的
               谱、SCIEX X500B QTOF-高分辨质谱仪（上海爱博                   甲 醇 溶 液 ， 振 荡   5  min 充 分 提 取 代 谢 物 。 4  ℃,
               才思分析仪器贸易有限公司）；ACQUITY UPLC M-                    14 000 r/min 离心  10 min，收集上清液并挥干。代谢
               Class 系统（美国沃特世科技有限公司）；Orbitrap                   物沉淀复溶于预冷甲醇-水（1∶1）100 μL，供                 LC-
               Fusion Lumos 质谱仪（美国赛默飞世尔公司）。                     QTOF-MS   分析  [5−6] 。
                1.3    动 物                                           色 谱 分 离 采 用     Waters  Acquity  UPLC  HSS
                    7 周龄雌性    SD  大鼠，体重为（180±20） g，购自           T3 色谱柱（2.1 mm × 100 mm,1.8 μm），流动相       A  为
               江苏华创信诺医药科技有限公司，生产许可证号：                           含  0.1%  甲酸的水溶液，流动相           B  为乙腈，流速
               SCXK（苏）2020-0009。动物福利和实验操作严格                     0.35  mL/min， 柱 温 为  40  ℃。 色 谱 梯 度 为 ： 1.5~
               遵守《实验动物管理条例》及相关国家法规，所有实                          2.0 min（1% → 20% B），2.0~12.0 min（20% → 70% B），
               验程序均获得中国药科大学动物伦理委员会批准，                           12.0~13.5 min（70% B），13.5~15.0 min（70% → 99% B），
               伦理批准号：YSL-202503065。                             15.0~15.1 min（99% → 1% B），15.1~20.0 min（1% B）。
                                                                     质谱检测使用电喷雾电离源（ESI）正/负离子
                2    方 法
                                                                模式交替扫描。基于色谱保留时间和质谱碎片特
                2.1    模型构建与评价                                  征参考文库数据进行化合物鉴定。基于峰面积对
                    动物于温度       20~26 ℃、湿度     40%~70%，12 h     代谢物的丰度进行相对定量。
               昼夜轮替条件下适应性饲养               7 d 后，按体重随机                原始数据经      XCMS 3.0 进行特征峰提取，中心
               分为对照组和        PCOS  组（n=8）。将来曲唑溶解于               化与单位方差归一化预处理 。通过                SIMCA v16.0.2
                                                                                        [7]
               10 mg/mL  羧甲基纤维素钠悬浮液中，配制成浓度                      软件进行偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）及正交
               为  0.2 mg/mL  的混悬液。根据动物体重计算给药                    偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）分析。差异代谢
               体积，PCOS    组动物每日灌胃给予来曲唑，剂量为                      物（differentially accumulated metabolites, DAMs）的
               1 mg/kg，连续   21 d；对照组每日灌胃给予等体积的                  筛选标准为       OPLS-DA  变量重要性投影（variable
               羧甲基纤维素钠溶液。自造模开始至实验结束，隔                           importance in projection, VIP）>1.0 且独立样本  t 检
               日称重以分析其体重变化趋势。同时，自造模后                            验  P<0.05。 DAMs 经    KEGG  数 据 库 注 释 ， 通 过
               10 d 内，采集阴道脱落细胞，以角化上皮细胞占比                        MetaboAnalyst  6.0（ www.metaboanalyst.ca） 平 台 进
                                [4]
               评价发情周期变化 。                                       行通路富集分析（P<0.05），显著性阈值为               P<0.05 且
                    造模结束腹主动脉取血并处死大鼠。采用酶                         通路影响值（Impact）>0.1。
               联免疫吸附法测定血清雌二醇、促黄体生成素、空                            2.3    蛋白质组学分析
               腹胰岛素、睾酮和促卵泡生成素的含量。胰岛素抵                                卵巢组织以裂解液（2% SDS，0.01 mol/L Tris-
               抗程度通过稳态模型评估指数（homeostasis model                  HCl，pH 7.6）匀浆，14 000 r/min，4 ℃    离心   20 min
               assessment of insulin resistance, HOMA-IR）进行评    提取总蛋白，BCA         法定量后取蛋白         1 μg。依次
               估，计算公式为：HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5。其                进行：10 mmol/L 二硫苏糖醇还原（95 ℃, 5 min）、
               中， FPG 表示空腹血糖（单位：mmol/L），FINS 表示                 10 mmol/L 碘乙酰胺烷基化（避光，室温， 45 min）、
               空腹胰岛素（单位：μIU/mL）。摘取双侧卵巢，测量                       10 mmol/L 二硫苏糖醇二次还原（37 ℃，30 min） 。
                                                                                                           [8]
               体积并称重，计算卵巢指数（卵巢指数=双侧卵巢质                          SP3 磁珠富集（磁珠与蛋白质量比为                 10∶1），70%
               量/体质量）。其中一侧卵巢于            4%  多聚甲醛固定      24 h   乙腈结合，经乙腈和         80%  乙醇分别洗涤，20 mmol/L
               后，脱水透化和石蜡包埋，制备为               5 μm  切片。切片        NH HCO 重悬。胰蛋白酶          37 ℃  酶解  16 h，肽段冻
                                                                        3
                                                                   4
               经苏木精-伊红（HE）染色，显微观察组织结构和卵                         干用于质谱检测        [9−10] 。
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