Page 7 - 《渔业研究》2026年第2期
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150 渔 业 研 究 第 48 卷
检测 GPR43 基因在卵形鲳鲹各组织中的表达水 24 h，待细胞稳定后，吸出旧培养基，更换为不同
平。反应体系 10.0 μL：SYBR Green Premix Pro 营养成分的培养基并分为对照组、饥饿组和高糖组
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Tag HS qPCR 5.0 μL、cDNA 模板 1.0 μL、上/下游 （表 3） 。
引物各 0.5 μL 和 Nuclease-Free Water 3.0 μL。qRT- 表 3 培养基营养成分
PCR 反应程序：95 ℃ 30 s；95℃ 15 s，60 ℃ 30 s， Tab. 3 Nutrient composition of the culture medium
40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每 组别 葡萄糖/（μL/孔） 胎牛血清/%
种组织 3 个生物学重复、3 个技术性重复。使用 Groups Glucose/(μL/well) Fetal bovine serum
对照组 Control group 0 10
2 −∆∆Ct 方法分析 GPR43 基因在健康卵形鲳鲹各组织
高糖组 High-glucose group 2 10
中的相对表达水平；显著性分析采用单因素方差分
饥饿组 Fasted group 0 0
析（One-way ANOVA） ，P<0.05 为差异显著，P<
0.01 为差异极显著；使用 GraphPad Prism 9.0 软件 在分组培养后的 0、6、12 和 24 h 进行细胞
绘图。 取样，将培养基移入 1.5 mL RNase-free 离心管，
1.2.5 不同饲料投喂对 GPR43 基因表达的影响 3 000 r/min 离心 5 min，弃去上清液，保留细胞沉
随机选取试验基地暂养的 150 尾卵形鲳鲹，每 淀；孔内加入 1 mL 胰蛋白酶消化液消化 1~2 min
组 50 尾，分为 3 组，均在室外网箱养殖 7 d，其中 后，反复吹打，随后用移液器将含细胞的胰蛋白酶
第 1 组投喂常规饲料（对照组） ；第 2 组投喂高糖 吸入到新的 1.5 mL RNase-free 离心管中，3 000 r/min
饲料（高糖组） ，每日定时投喂一次；第 3 组在实 离心 5 min，弃去上清液，保留细胞沉淀；将上述
验期间暂停投喂，作为饥饿组。于第 8 天投喂后 2 管细胞沉淀合二为一，随后加入 1 mL Trizol，做
的 0、6、12 和 24 h [17-18] ，每组随机抽取 3 尾卵形 好相应标记，置于−80 ℃ 冰箱冻存，用于进一步
鲳鲹，设置 3 个平行，根据组织表达水平的检测结 的 RNA 提取、cDNA 合成，并进行 qRT-PCR，方
果，分离组织表达水平最高的肝脏与肌肉组织，放 法同 1.2.1、1.2.4。
入无菌冻存管中，液氮速冻，随后转移至−80 ℃ 冰
2 结果与分析
箱冻存，用于进一步的 RNA 提取、cDNA 合成，
并进行 qRT-PCR，方法同 1.2.1、1.2.4。 2.1 GPR43 基因氨基酸序列结构分析
1.2.6 卵形鲳鲹原代肝脏细胞的分离与刺激 对卵形鲳鲹 GPR43 基因进行理化性分析，结
1）体外分离卵形鲳鲹原代肝脏细胞 果表明，卵形鲳鲹 GPR43 基因 CDS 长 1 011 bp，
从尚未进行分组投喂实验的室外网箱中随机挑 编码 336 个氨基酸（图 1） 。通过 Ex-pasy 软件预
选 4 尾健康的卵形鲳鲹进行肝脏原代细胞的分离。 测（图 2）发现，其蛋白质分子量大小约 38.24 kDa，
抽血后取其体内肝脏，放置在含 4% 青霉素−链霉 相对分子质量为 86 072.66，理论等电点（Isoelectric
素抗生素的 1×PBS 的一次性培养皿中；用镊子将 point，pI）为 5.02，有信号肽的概率为 6.339%，不
肝脏上的筋膜剔除干净后，将肝脏移入装有 2 mL 稳定指数为 55.49，脂肪系数为 21.17。亲/疏水性
胰酶的无菌培养皿中，使用解剖剪将肝脏剪至大小 结果（图 3）显示，最大疏水值位于第 201 位氨基
为 1 mm 的碎块，静置 10 min；随后加入 2 倍体 酸，数值为 3.033，最小疏水值位于 324 位氨基酸，
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积的完全培养基（4 mL）中和胰酶，终止消化； 数值为−2.700，亲/疏水系数总平均值为 0.788，表
使用细胞过滤器（100 μm 孔径）过滤消化后的组 明该蛋白为疏水性蛋白。
织碎块，在 4 ℃ 800 g 条件下离心 15 min，弃去上 2.2 GPR43 蛋白结构及跨膜预测
清液；最后在离心管内加入适量无菌 PBS，混匀细 对卵形鲳鲹 GPR43 蛋白进行二级结构预测，
胞，在 4 ℃ 800 g 条件下离心 15 min，弃去上清 结果（图 4）显示，GPR43 蛋白主要由三部分组
液，并加入等体积含 10% 血清的培养基，轻轻吹 成，分别是 α-螺旋（蓝色）占 44.35%，无规则卷
散备用。根据实验需要，调整细胞浓度铺板。 曲（黄色）占 41.37%，延伸链（紫色）占 14.29%，
2）肝脏原代细胞分组 可见 GPR43 蛋白以 α-螺旋和无规则卷曲为主。对
用适量完全培养基将分离出的卵形鲳鲹原代肝 卵形鲳鲹 GPR43 蛋白进行扑朔结构及跨膜区进行
脏细胞吹打混匀制成细胞悬液，使用 6 孔板铺板， 预测，结果（图 5）显示，GPR43 蛋白在 10~252
每孔加入 2 mL 细胞悬液，放入 28 ℃ 培养箱培养 氨基酸序列中有 7 个连续 α-螺旋跨膜结构区域。
