Page 6 - 《渔业研究》2026年第2期

第 2 期 庾 娜等： 卵形鲳鲹 G 蛋白偶联受体 43 基因克隆及营养调控分析 149

表 1 饲料组成及营养水平 泳验证其 RNA 的完整性，保存于−80 ℃ 备用；使

Tab. 1 Feed composition and nutritional levels 用 EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA
®
成分 常规饲料/% 高糖饲料/% Synthesis SuperMix 试剂盒，按照说明书将 RNA 反
Ingredients Conventional High-glucose
feed feed 转成 cDNA，产物置于−20 ℃ 保存，用于后续基因
鱼粉 Fish meal 30.00 30.00 克隆和 qRT-PCR。
猪肉粉 Pork meat powder 6.00 6.00 1.2.2 GPR43 基因蛋白质编码区（Coding sequ-
大豆浓缩蛋白 ence，CDS）克隆
Soy protein concentrate 7.00 7.00
从本实验室前期转录组测序数据库中检索获得
酪蛋白 Casein protein 10.00 10.00
卵形鲳鲹 基因。根据检索获得预测序列
啤酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 2.00 2.00 GPR43
GPR43 基因的 CDS 序列，利用 Primer 5.0 设计克
玉米淀粉 Maize starch 18.00 36.00
隆卵形鲳鲹 基因所需的特异性引物
鱼油 Fish oil 6.00 6.00 GPR43 To-
GPR43-F/To-GPR43-R（表 2） 。将健康卵形鲳鲹
大豆卵磷脂 Soy lecithin 1.00 1.00
氯化胆碱 Choline chloride 0.10 0.10 肝脏组织 cDNA 原液稀释 10 倍，进行聚合酶链
抗氧化剂 Antioxidant agent 0.10 0.10 式反应（Polymerase chain reaction，PCR）扩增，
维生素预混 Vitamin premix 0.50 0.50 20 μL 反应体系：2×Rapid Taq Master Mix 10 μL、上
矿物质预混 Mineral premix 0.50 0.50 下游引物各 1 μL、cDNA 2 μL 和无菌去离子水 6 μL；
微晶纤维素 反应程序：95 ℃ 5 min、40 个循环（95 ℃ 15 s、57 ℃
Microcrystalline cellulose 18.30 0.30
15 s、72 ℃ 10 s）和 72 ℃ 10 min。将 PCR 产物经
磷酸二氢钙
Calcium hydrogen phosphate 0.50 0.50 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测合格后，利用切胶回收
粗蛋白 Crude protein 40.33 40.36 试剂盒对 PCR 产物进行切胶回收，使用 pMD18-T
粗脂肪 Crude lipid 10.40 10.63
载体进行 T-A 克隆，并转化至大肠杆菌 DH5α 感
粗灰分 Crude ash 9.29 9.41 受态细胞，挑选阳性克隆进行鉴定，委托生工生物

工程（深圳）股份有限公司进行测序。将得到的序

表 2 本研究所用引物 列进行拼接，获得该基因的全长序列。
Tab. 2 Primers employed in the present study 基因生物信息学分析
1.2.3 GPR43
引物名称 序列（5’—3’） 用途 对已克隆鉴定的卵形鲳鲹 GPR43 基因进行生
Primer name Sequence (5’—3’) Purposes
物信息学分析，首先在美国国家生物技术信息中
To-GPR43-F ATGCAGGAGTGCCACACT ORF 克隆
心（National Center for Biotechnology Information，
To-GPR43-R TCAGATAGCATTGATCTCCTGT ORF 克隆
NCBI）下载已公布的相关物种的 GPR43 基因序
qTo-GPR43-F CCACCTGAGCATTGTCTT qRT-PCR
列，再使用 MEGA 11 软件进行相似性分析并构建
qTo-GPR43-R GCTGAGCCTCTGTGAAAT qRT-PCR
系统发育进化树；在线使用 ExPASy Server 工具中
qTo-β actin-F GCTACGTCGCCCTGGACTTC qRT-PCR
的 ProtParam 程序分析卵形鲳鲹 GPR43 蛋白理化
qTo-β actin-R CTCATGGATTCCGCAGGACTC qRT-PCR
性质；使用 ProtScale 程序分析卵形鲳鲹 GPR43 蛋
注：ORF. 开放阅读框；qRT-PCR. 实时荧光定量聚合酶链式
反应。 白特性；使用 SignalP 6.0 程序预测卵形鲳鲹 GPR43
Notes: ORF. Open reading frame; qRT-PCR. Quantitative real-time 蛋白信号肽；使用 Deep-TMHMM 程序预测跨膜结
polymerase chain reaction.
构域；使用 SPOMA 预测 GPR43 蛋白的二级结构。
1.2 实验方法 1.2.4 GPR43 基因在组织中的表达特征分析
1.2.1 总核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）提 在试验基地随机捞取暂养的 3 尾健康卵形鲳
取及 cDNA 合成 鲹，分别采集心脏、肝脏、头肾、肠、肌肉、脑、
随机选取试验基地暂养的 3 尾健康卵形鲳鲹， 鳃、皮肤、眼和脾等 10 个组织，参考 1.2.1 方法获
于超净台中无菌解剖，根据 Trizol 试剂盒说明书分 得 cDNA。随后将合成的 cDNA 稀释 10 倍作为模
别提取其心脏、肝脏、头肾、肠、肌肉、脑、鳃、 板，分别以 qTo-GPR43-F/R 和 qTo-β actin-F/R（内
皮肤、眼和脾 10 个组织的总 RNA，用 NanoDrop 参）为引物，每个样品设置 3 个平行，按照 SYBR @
2000C 检测 RNA 浓度，并用 1.5% 琼脂糖凝胶电 Green Premix Pro Tag HS qPCR 说明书进行 qRT-PCR，