Page 46 - 《渔业研究》2025年第6期

第 6 期 戴景辉等：蛙源与鱼源无乳链球菌的遗传分化、基因分型、毒力谱、耐药性与致病性比较研究 737

1.11 人工回归感染 号为 PV707033、PV707034、PV707036、PV707037、
实验所用健康牛蛙 [ 平均体质量为（180.5± PV707038、PV707040 和 PV707042。并利用 BLA-
11.2）g] 购自四川省周边一个无病害记录的养殖 ST 对比分析，结果表明，所有菌株的 16S rRNA
场。实验前，牛蛙暂养于 3 个容量约为 20 L 的塑 基因序列均与无乳链球菌参考株序列高度一致，
料水箱中（每组 n=10） ，水温维持在（28±1）℃， 其中大多数菌株相似性≥99%，支持其为无乳链球
暂养 7 d 以适应实验环境。选取一株来源于病死牛 菌属。

#
蛙的无乳链球菌分离株（25 ）和一株来源于病死
a) b)
尼罗罗非鱼的无乳链球菌分离株（TW2021-21）作
为攻毒菌株。2 株菌分别接种于 BHI 培养基，于
A A’
30 ℃ 条件下振荡培养 24 h 后，采用平板计数法测 B B’
定菌悬液浓度，分别为 5.1×10 CFU/mL（蛙源 25 ）
#
7
和 8.4×10 CFU/mL（尼罗罗非鱼源 TW2021-21）。实
7
验组牛蛙经后肢肌肉注射 0.5 mL 相应菌悬液；对
照组注射等量无菌生理盐水。注射后，各组牛蛙继 c) d)
续于原水温条件下饲养，连续观察 7 d，记录其临
床症状和死亡情况。本研究中涉及的人工回归感染
实验均严格遵循《实验动物管理条例》和相关动物
C C’
福利指导原则，并经通威农业发展有限公司伦理委
员会审核批准，伦理审查编号为 TW20250728。

2 结果与分析
图 1 不同宿主源分离菌株在不同温度条件下菌落生长特性
2.1 菌株复苏与培养 Fig. 1 Colony growth characteristics of different host-
为初步探究不同宿主来源的无乳链球菌对培养 source isolated strains under different temperature
温度的适应性及其生长能力差异，分别将蛙源与尼 conditions
罗罗非鱼源菌株接种于血琼脂平板中，于 28 ℃ 和 注：a. 28 ℃ 培养 24 h 菌落生长情况；b. 37 ℃ 培养培
37 ℃ 条件下进行对比培养，结果如图 1 所示。在 养 24 h 菌落生长情况；c. 28 ℃ 培养 24 h 菌菌落溶血性观
察；d. 37 ℃ 培养 24 h 菌菌落溶血性观察；A. 蛙源分离株
两种培养温度下，蛙源与尼罗罗非鱼源菌株均可生
（28 ℃，24 h） ；B. 尼罗罗非鱼源分离株（28 ℃，24 h） ；
长。然而，与 28 ℃ 条件相比，蛙源菌株在 37 ℃ A’. 蛙源分离株（37 ℃，24 h） ；B’. 尼罗罗非鱼源分离株
条件下生长受限明显（图 1b-A’） ，菌落体积较 （37 ℃，24 h） ；C. 尼罗罗非鱼源（28 ℃，24 h）溶血性
观察；C’. 尼罗罗非鱼源（37 ℃，24 h）溶血性观察。
小，生长速度较慢。相反，尼罗罗非鱼源菌株在
Notes: a. Colony morphology of isolates cultured at 28 ℃ for
37 ℃ 下的菌落更大，菌苔更厚，生长更为旺盛 24 h; b. Colony morphology of isolates cultured at 37 ℃ for 24 h;
（图 1b-B’） ，提示其对较高温度具有更强的适应 c. Hemolytic activity of isolates cultured at 28 ℃ for 24 h; d. He-
能力。此外，不同菌株在血琼脂培养基中形成的溶 molytic activity of isolates cultured at 37 ℃ for 24 h; A. Frog-sou-
rce isolate (cultured at 28 ℃ for 24 h); B. Tilapia-derived isolate
血圈亦存在差异。在 37 ℃ 培养条件下，尼罗罗非
(cultured at 28 ℃ for 24 h); A’. Frog-source isolate (cultured at 37 ℃
鱼源菌株所形成的溶血圈（图 1d-C’）明显大于其 for 24 h); B’. Tilapia-derived isolate (cultured at 37 ℃ for 24 h);
在 28 ℃ 条件下的表现（图 1c-C） ，提示其在高温 C. Hemolytic activity of tilapia-derived isolate at 28 ℃ for 24 h;
条件下可能具有更强的溶血活性，间接反映其潜在 C’. Hemolytic activity of tilapia-derived isolate at 37 ℃ for 24 h.

的较高致病力。 为明确各分离菌株的系统发育关系，本研究基
2.2 16S rRNA 鉴定与系统发育树分析 于 16S rRNA 基因序列对 7 株无乳链球菌分离株构
为鉴定分离菌株的种属归属，本研究采用单向 建系统发育树，如图 2 所示。尼罗罗非鱼源菌株
引物对本文 7 株无乳链球菌分离株（14 、19 、 TW2018-78、TW2021-21 与 GenBank 中广东、海
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20 、24 、25 、TW2018-78、TW2021-21）进行 16S 南和广西地区的尼罗罗非鱼以及金鲳（Trachinotus
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rRNA 基因扩增，所得 PCR 产物经纯化后进行测 ovatus）来源的无乳链球菌参考菌株形成高支持
序，测序结果分别上传至 GenBank 数据库，登录 率单系群（Bootstrap>90%） ，表明该类菌株具有