Page 42 - 《渔业研究》2025年第6期

第 6 期 戴景辉等：蛙源与鱼源无乳链球菌的遗传分化、基因分型、毒力谱、耐药性与致病性比较研究 733

随着中国蛙类养殖业的快速扩张，链球菌感染 化，但研究亦发现部分关键基因（如毒力因子和抗
在蛙类中的风险逐步显现。已有研究报道了从病死 性基因）可通过水平基因转移方式在不同宿主间传
牛蛙（Rana catesbeiana）中分离出非溶血型、γ 溶 播，从而突破宿主屏障，增加其跨种传播和感染的
血型和 β 溶血型的无乳链球菌 [6-8] 。2022 年，Di 等 [9] 潜力 [20] 。

首次鉴定出牛蛙源无乳链球菌为Ⅰb-ST261 型； 此外，水产养殖中抗生素的频繁使用促使无乳
2023 年，马哲昊等 [10] 则指出虎纹蛙（Hoplobatra- 链球菌产生多重耐药性。研究表明，不同宿主来源
chus occipitalis）源菌株为Ⅲ-ST739 型。2024 年， 菌株对常用药物（如氟苯尼考、恩诺沙星、阿莫西
Sun 等 [11] 进一步分离得到 1 株海豚链球菌（Strepto- 林、强力霉素等）的耐药性存在显著差异，并检测
coccus iniae） ，提示蛙类可感染多种链球菌，感染 到 tetM、ermB、floR、sul1 等多种耐药基因 [21–24] 。
谱复杂多样。然而，相较鱼类链球菌病的深入研 但目前对蛙源菌株的耐药谱、耐药机制及其与鱼源
究，蛙源链球菌感染的系统性研究仍明显不足，相 菌株的系统性差异尚缺乏深入研究。
关遗传背景和致病机制尚不清楚。 鉴于此，本研究通过比较分析蛙源与尼罗罗非
在无乳链球菌的分子鉴定方面，cfb 基因作为 鱼（Oreochromis niloticus）源无乳链球菌的表型特
其特异性标志序列，已被广泛用于分子水平的快速 征（如溶血性、血清分型） 、分子分型（MLST） 、
检测与种属鉴定。cfb 基因编码的 CAMP（Christie- 毒力因子组成及药物敏感性，旨在系统揭示其在致
Atkins-Munch-Petersen）因子不仅具备良好的保守 病性与耐药性方面的差异，为水产养殖中无乳链球
性和特异性，且广泛存在于不同宿主来源的无乳链 菌的防控与用药提供理论依据和技术支撑。
球菌中，是当前聚合酶链式反应（Polymerase chain
1 材料与方法
reaction，PCR）和环介导等温扩增技术（Loop-me-
diated isothermal amplification，LAMP）等分子检 1.1 菌株来源
测方法中常用的靶基因之一 [12] 。该基因的检测在 本研究所采用的不同宿主来源无乳链球菌菌株
提高链球菌分类准确性、比对不同宿主来源菌株时 由通威农业发展有限公司动物保健研究所分离并保
具有重要价值。 存（表 1） ，共计 7 株：黑斑蛙（Pelophylax nigroma-
当前研究表明，无乳链球菌在不同宿主间存在 culatus，2024，四川）1 株、牛蛙（2024，四川）
显著的遗传结构差异，主要体现在血清型、多位点 2 株 、 牛 蛙 （ 2024， 广 西 ） 2 株 、 尼 罗 罗 非 鱼
序列分型（Multilocus sequence typing，MLST） 、 （2018，广东）1 株、尼罗罗非鱼（2021，海南）
毒力因子谱和耐药性等方面的多样性。在鱼类宿 1 株 。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （ Staphylococcus aureus）
主中，菌株以血清型Ⅰa 为主，占比高达 95.2%， ATCC25923 购自国家标准菌株保藏中心。
MLST 分型主要为 ST7 和 ST261。其中，ST7 型菌 1.2 实验材料与设备仪器
株常携带 bac、bca 等表面抗原，致病性相对较低； 血琼脂平板培养基、脑心浸液（Brain-heart
而Ⅰb-ST261 型虽缺乏这些抗原，但通过高表达黏 infusion，BHI）培养基及技术琼脂粉购自广东环凯
附因子 bibA 而展现出更强的毒力 [13-16] 。在人类宿 微生物科技有限公司（中国，广州） ；细菌脱氧核
主 中 ， 菌 株 主 要 属 于 血 清 型 Ⅲ型 （ 61%） 和 糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂
Ⅰa 型，MLST 多见于侵袭性序列型 CC17 和定植 盒及 DNA Marker 购自成都福际生物技术有限公司
性序列型 CC19。这些菌株普遍携带 scpB、hly、 （中国，成都） ；革兰氏染色液及药敏纸片购自杭
bca 等毒力基因，构成典型的 scpB-hly-rib-bca 毒力 州微生物试剂有限公司（中国，杭州） 。PCR 扩
谱 [17-18] 。牛源菌株则以血清型Ⅰa、Ⅱ和Ⅲ型为 增仪为 Eppendorf AG 22331 Hamburg（德国） ；凝
主，常见 CC23 和 CC67 等 MLST 分型，但其毒力 胶成像系统为 GEL DOC 2000 Bio-Rad Laboratories
基因携带率相对较低，仅有部分菌株保留 rib 基 Inc.（美国） 。
因 [17] 。在两栖类宿主中，虎纹蛙分离的无乳链球 1.3 菌株复苏与培养
菌主要为Ⅲ-ST739 型、牛蛙为Ⅰb-ST261 型 [9-10, 19] ， 将−80 ℃ 保存的菌株冻存液取出，于室温条件
其分型与人源、鱼源菌株均明显不同，提示其可能 下解冻复苏。在无菌条件下划线接种于血琼脂固体
经历了独立的宿主适应性进化过程。值得注意的 培养基平板，置于 28 ℃ 恒温培养箱中培养 24 h。菌
是，尽管无乳链球菌在宿主间存在一定的遗传分 落生长后，采用革兰氏染色法初步观察细菌的形态