Page 44 - 《渔业研究》2025年第6期

第 6 期 戴景辉等：蛙源与鱼源无乳链球菌的遗传分化、基因分型、毒力谱、耐药性与致病性比较研究 735

DNA 为模板，采用多重 PCR 扩增无乳链球菌荚膜 信息提交至 MLST 数据库，申请新的等位基因编
多糖基因簇特异性片段。扩增产物在 1.5% 琼脂糖 号及序列型。

凝胶中，通过水平电泳分离分析。根据扩增条带在 表 4 无乳链球菌管家基因位点的相关实验参数
凝胶中呈现的一种、两种或三种特异性条带模式， Tab. 4 The parameters of the housekeeping gene locus
对各分离株进行荚膜类型判定 [27] 。用于检测无乳 of S. agalactiae
链球菌荚膜多糖基因簇的多重 PCR 扩增条件同 目标基因 序列（5’—3’ ） 扩增产物大小/bp
上，引物信息如表 3 所示。 Target genes Sequences (5’—3’) Amplicon size

F-GTTGGTCATGGTGAAGCACT
表 3 荚膜多糖不同分型特异性引物及 PCR 扩增产物大小 adhP 672
R-ACTGTACCTCCAGCACGAAC
Tab. 3 Capsular polysaccharide serotype-specific
F-GATTAAGGAGTAGTGGCACG
primers and corresponding PCR product sizes pheS 723
R-TTGAGATCGCCCATTGAAAT
扩增
引物 序列（5’—3’ ） 长度/bp F-CGATTCTCTCAGCTTTGTTA
Primers Sequences (5’—3’) Fragment atr R-AAGAAATCTCTTGTGCGGAT 627
length
F-CCGGCTACAGATGAACAATT
F-GGTCAGACTGGATTATATGGTATGC glnA 589
Ⅰa 521， R-CTGATAATTGCCATTCCACG
R-GTAGAAATAGCCTATATAACGTTGAATGC 1 826
F-AGAGCAAGCTAATAGCCAAC
F-TAAACGAGAATGGGAATATCACAACACC sdhA 646
Ⅰb 770 R-ATATCAGCAGCAACAAGTGC
R-GAATTAACCTCAATCCCTAAACAATATCG
F-CTCGGAGGAACGACCATTAA
F-GCTTCAGTAAGTATGTGGAAGACGATAG glcK 607
Ⅱ 397 R-CTTGTAACAGTATCACCGTT
R-TTCTCTAGGAAAATCAAATAATTCTATAGGG
F-CCAGGCTTTGATTTAGTTGA
tkt 859
F-TCCGTACTACAAACAGACTCATCC
Ⅲ 1 826 R-AATAGCTTGTTGGCTTGAAA
R-AGTAACCGTCCCATACATCTCTATAAGC
1.9 毒力基因测定
F-GGTGGTAATCCTAAGAGATGAACGT
Ⅳ 578 鉴于无乳链球菌具有多种毒力因子，在免疫原
R-CCTCCCCAATTTCGTCCATAATGGT
性、黏附与侵袭、溶血性损伤及免疫逃逸等方面共
F-GAGGCCAATCAGTGGCACGTAA
Ⅴ 701 同促进其致病力 [29] ，本研究分别选择与上述功能
R-AACCTTCTCCTTCCACATAATCCT
相关的典型毒力基因作为检测靶标，用于评估菌株
F-GGACTTGAGATGGGCAGAAGGTGAA
Ⅵ 487 的致病潜力。针对上述 7 株不同宿主来源的无乳链
R-CTGTCGGACTATCCTGATGAATCTC
球菌中存在的 9 个毒力相关基因进行检测，具体方
F-CCTGGAGAGAACAAATGTCCAGAT
Ⅶ 371 法、引物信息与扩增条件如表 5 所示。最终 PCR
R-GCTGGTCGTGATTCTACACA
扩增产物利用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行检测，拍
F-AGGTCAACCACTATATATAGCGA
Ⅷ 282 照记录并判定结果。
R-TCTTCAAATTCCGCTGACTT
1.10 药敏实验与耐药基因测定
F-AGGAATACCAGGCGATGAACCGAT
dltS 952 选取上述 7 株不同宿主来源的无乳链球菌分
R-TGCTCTAATTCTCCCTTATGGC
离株，采用纸片扩散法（Kirby-Bauer 法）进行体

1.8 MLST 基因分型分析 外药物敏感性实验，按照美国临床和实验室标准
MLST 采用 Jones 等 [28] 的方法，所用的 PCR 协会《M100 抗微生物药敏试验性能标准》 （第
扩增引物序列参照 MLST 数据库（http://pubmlst. 31 版） [30] 指导操作，将结果分为敏感（S） 、中
org/），选取 7 个管家基因（adhP、pheS、atr、glnA、 敏感（I）和耐药（R） 。测试抗生素包括氟苯尼
sdhA、glcK 和 tkt）进行 PCR 扩增，相应引物序列 考、强力霉素、恩诺沙星、硫酸新霉素、复方新诺
见表 4，引物由成都擎科生物技术有限公司合成。 明、阿莫西林以及头孢噻肟。根据药敏结果，提取
测序所得序列提交至 MLST 数据库（http://pubmlst. 菌株基因组 DNA，分别采用 PCR 检测 floR（氟苯
org/）进行比对，获取对应的等位基因编号和序列 尼考） 、sul1（磺胺类） 、aac(6’)-Ⅰb-cr（氨基糖
型（Sequence types，STs） 。若无法通过 BLAST 苷类） 、tetM（四环素类） 、ermA（大环内酯类） 、
比对确定序列型，则将 7 个管家基因的序列及菌株 ermB（大环内酯类） 、qnrS（喹诺酮类）以及 pbp2x