Page 43 - 《渔业研究》2025年第6期

734 渔 业 研 究 第 47 卷

特征及染色性质。在此基础上，进一步将菌株接种于 分别于 28 ℃ 和 37 ℃ 培养，并观察不同宿主来源菌
血琼脂固体培养基平板，在相同培养时间（24 h）下， 株在 2 种温度条件下的菌落生长情况和丰度差异。

表 1 无乳链球菌菌株相关信息
Tab. 1 The relevant information of S. agalactiae
代表菌株 分离宿主 分离时间 分离地址 分离部位 主要症状
Representative strains Hosts Time Locations Tissue locations Cardinal symptoms
14 # 黑斑蛙 2024 四川 肝脏
19 # 牛蛙 2024 四川 肝脏
软体红腿，腹水，肝脏出血或黄疸状，
20 # 牛蛙 2024 四川 肝脏
消化道（胃）溃疡出血、肠炎
24 # 牛蛙 2024 广西 肝脏
25 # 牛蛙 2024 广西 肝脏
TW2018-78 尼罗罗非鱼 2018 广东 肝脏 晶状体混浊发白，眼球突出、充血，
TW2021-21 尼罗罗非鱼 2021 海南 肝脏 脑膜充血，肝脏充血肿大，肠炎

1.4 16S rRNA 扩增与系统发育树分析 1.0 μL，模板 1.0 μL，ddH O 15.0 μL。循环条件：
2
使用成都福际生物科技有限公司提供的细菌基 94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃ 变性 1 min，48 ℃ 退火
因组 DNA 提取试剂盒，按照说明书操作提取 7 株 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，扩增 30 个循环；72 ℃
不同宿主来源菌株的基因组 DNA，同时以 Weisburg 延伸 5 min。

等 [25] 报道的方法进行 16S rRNA PCR 扩增。PCR 表 2 无乳链球菌 cfb 基因位点相关实验参数
反应体系：2×Premix Taq 25 μL，上下游引物（浓 Tab. 2 The parameters of the cfb gene locus of
度为 10 μmol/L）各 2 μL，DNA 模板 1 μL（20~ S. agalactiae
100 ng） ，ddH O 2 补足至 50 μL。PCR 扩增程序： 引物 序列（5’—3’ ） 扩增长度/bp
94 ℃ 预变性 5 min；94 °C 变性 30 s，55 ℃ 退火 Primer Sequence (5’—3’) Fragment length
F-AAGTACATGCTGATCAAGT
30 s，72 ℃ 延伸 1.5 min，35 个循环；72 ℃ 温育 cfb 401
R-TCTTGATCAACTTGTTGTAC
10 min。PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测
后，由成都擎科生物技术有限公司（中国，成都） 1.6 溶血性与 CAMP 实验
进行双向测序。 将上述不同宿主来源的无乳链球菌菌株，分别
所得序列在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对， 划线接种于血（琼脂）固体培养基平板，在其相对
以初步鉴定菌株的种属信息。为进一步明确各菌株 最适培养温度条件下恒温培养 24 h，观察并记录菌
间的系统发育关系，使用 MEGA XI 软件对测得序 落周围的溶血现象，评估其溶血性特征。
列及其近缘参考序列进行多序列比对（Multiple 同时，按 Honkanen-Buzalski 等 [26] 报道的方法
sequence alignment） ，采用邻接法（Neighbor-join- 进行 CAMP 实验，将金黄色葡萄球菌标准菌株
ing，NJ）构建系统发育树，自举分析（Bootstrap （ATCC 25923）接种于血（琼脂）固体培养基平
analysis）重复采样次数设为 1 000 次，以评估系统 板，并于 37 ℃ 条件下培养过夜。随后，在新的平
发育关系的可靠性。 板中央沿直线接种金黄色葡萄球菌，用以产生 β-溶
1.5 基于 cfb 基因特异性 PCR 检测 血素。各无乳链球菌分离株分别以 90°角朝向金黄
在 16S rRNA 基因测序初步鉴定为无乳链球菌 色葡萄球菌划线方向接种，并保持一定的距离，避
的基础上，为进一步验证其种属特异性，参照王均 免直接接触。平板在 37 ℃ 下继续培养 24 h 后，观
等 [12] 的方法，以 cfb 基因全长序列（预期扩增片段 察不同宿主来源无乳链球菌划线与金黄色葡萄球菌
大小为 401 bp）为目标序列，对上述 7 株复苏菌株 划线交汇处是否形成典型箭头状溶血增强区。以箭
进行分子特异性鉴定。cfb 基因特异性引物由成都 头状溶血增强现象的出现判定为 CAMP 实验阳性。
擎科生物技术有限公司合成，其序列见表 2。 引物 1.7 荚膜多糖血清型分析
扩增采用 25 μL 反应体系：10×PCR 缓冲液 2.5 μL， 根据 Poyart 等 [27] 报道的方法，对 7 株不同宿
2+
25 mmol/ L Mg 1.525 μL，25 mmol/L dNTP 2.0 μL， 主来源的无乳链球菌的分离株进行荚膜多糖血清分
2.5 U/μL Taq DNA 聚合酶 1.0 μL，上/下游引物各 型。基因组提取方法参照 1.4 节。随后，以提取的