Page 212 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 吕彬彬，等：SGT1 介导自噬和凋亡促进罗氏沼虾抗氧化系统抵御嗜水气单胞菌感染 50 卷

物科技 (上海) 股份有限公司 ]，兔抗 ATG5 多克 织的混合 cDNA 为模板对 MrSGT1 的序列进行特
隆抗体和兔抗 Beclin1 多克隆抗体 (实验室前期制 异性扩增。PCR 扩增体系：cDNA 1 μL，SGT1-F
备 )， Western 及 IP 细 胞 裂 解 液 、 β-Actin Rabbit 2 μL，SGT1-R 2 μL，Green Taq Mix 10 μL，双蒸
Monoclonal Antibody、碱性磷酸酯酶标记山羊抗 水 (dd H O) 5 μL。PCR 扩增条件：94 ℃，5 min；
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兔 IgG (H+L)、丙二醛 (MDA) 检测试剂盒、总抗 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72
氧化能力检测试剂盒 (FRAP 法)、过氧化氢酶检测 ℃，10 min。使用 1% 琼脂糖凝胶电泳分离 PCR
试剂盒 (上海碧云天生物技术股份有限公司)。 产物，采用无菌的手术刀片将产物切胶回收，并
使用胶回收试剂盒提取 PCR 产物，将 PCR 产物
1.2 实验方法
连接至 pMD 18-T 载体，随后转化至大肠杆菌并
TM
基因克隆与生物信息学分析 根据 RNA 培养，挑取单菌落进行菌落 PCR 验证。将验证通
提取试剂盒说明书，从健康罗氏沼虾的不同组织 过后的菌液送至广州艾基生物技术有限公司测序
中提取总 RNA，并通过超微量核酸蛋白检测仪检 验证 MrSGT1 的序列正确性。
测 RNA 的质量和浓度。再按照 PrimeScript™ Ⅱ MrSGT1 基因的序列相似性分析通过 NCBI
1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书将提取 数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 提供的 BLAST
的 RNA 反转录为 cDNA 后，置于−20 ℃ 保存。 程序进行。多序列比对采用 Clustal X 和 DNA-
从本实验室前期获得的罗氏沼虾转录组数据 MAN 软 件 完 成 。 使 用 SWISS-PROT 在 线 工 具
中筛选得到 MrSGT1 的基因开放阅读框 (ORF) 序 (https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)
列，并基于此序列在 NCBI 中下载 MrSGT1 的基 分析蛋白的等电点 (pI) 和分子质量 (Mw)。潜在的
因全长序列。利用 Primer Premier 5 软件设计扩增 磷 酸 化 位 点 和 糖 基 化 位 点 通 过 NetNGlyc 平 台
MrSGT1 的特异性引物 (表 1)。以罗氏沼虾不同组 (http://www.cbs.dtu.dk/services/) 进行分析。SignalP

表 1 引物信息
Tab. 1 Primer information
引物名称 序列 (5′―3′) 用途 引物名称 序列 (5′―3′) 用途
primer name sequences (5′―3′) application primer name sequences (5′―3′) application
SGT1-F ATGAATGAAAATGGCAGTG 基因克隆 qRT-PCR- AAACAGTTGTGGATGGGTCTTT 实时荧光定量
gene clone ATG5-F PCR
SGT1-R TCACTGGTTCCACTTTTTGTATTC qRT-PCR- TTCCCCTATGGTATCTGGTAAG qRT-PCR
ATG5-R
qRT-PCR- TTATCCATCGTCTGCTTCTA 实时荧光定量 qRT-PCR- GAAGCACGAGGAGGAGAAAGCA
SGT1-F PCR Beclin1-F
qRT-PCR- TGACTTATTCATTGCTCTCT qRT-PCR qRT-PCR- CCGAAGTGACCGGAGTACCAGA
SGT1-R Beclin1-R
qRT-PCR- ATGTCATGGTGGAAGAAGAG qRT-PCR- CTGAATATGCAGAGAATGGAGG
EF-1α-F [22] LC3-F
qRT-PCR- AAAGTTGACCACCATACCAG qRT-PCR- GACAATGTGTAAGAACTGGGAC
EF-1α-R [22] LC3-R
qRT-PCR- TGAAACAGAGGAACGCAGGA dsMrSGT1-F GATTGGTATCAAACGGAATCCCAT RNA干扰
bax-F RNA
qRT-PCR- CTACTAAATACTTCCACGACCACG dsMrSGT1-R TCACTGGTTCCACTTTTTGTATTCC interference
bax-R
qRT-PCR- CAGGCGGCAAACACAAGAC dsMrSGT1- TAATACGACTCACTATAGGGAGAGA
cytc-F T7-F TTGGTATCAAACGGAATCCCAT
qRT-PCR- AAGGTAGGCTATCAAATCGGC dsMrSGT1- TAATACGACTCACTATAGGGAGATC
cytc-R T7-R ACTGGTTCCACTTTTTGTATTCC
qRT-PCR- TGAGGCACTGGTCTTGTCCAGAAT dsGFP-F [23] GTGCCCATCCTGGTCGAGCT
caspase 3-F
qRT-PCR- GGCACTTGCATTGACTGCTGGATT dsGFP-R [23] GCACGCTGCCGTCCTCGAT
caspase 3-R
qRT-PCR- TTGAAGGAGACAAACCCGT dsGFP-T7-F TAATACGACTCACTATAGGGAGAGT
ATG12-F GCCCATCCTGGTCGAGCT
qRT-PCR- CCATCTGAACCAAAGCACT dsGFP-T7-R TAATACGACTCACTATAGGGAGAGC
ATG12-R ACGCTGCCGTCCTCGAT

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