Page 213 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 水 产 学 报 50 卷

5.0 Server (https://services.healthtech.dtu.dk/service. 60 ℃，34 s，40 个循环，溶解曲线程序：95 ℃，
php?SignalP-5.0) 用于信号肽预测。SMART 数据 15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，15 s。采用
库 (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode. 2 −ΔΔCt 方法分析处理实验数据。
cgi) 用于蛋白结构域的注释与功能区域分析。通 RNA 干扰 基于罗氏沼虾 MrSGT1 的基因
过 MEGA 5.0 软件采用邻接法 (Neighbor-Joining, 序列和增强型绿色荧光蛋白 (GFP) 基因序列，利
NJ) 构建系统发育树，并进行 1 000 次自举重复验 用 在 线 软 件 siDirect (https://sidirect2.rnai.jp/) 预 测
证以评估分析结果的可靠性。此外，使用 siDirect RNA 干扰位点，再利用 Primer Premier 5 软件设计
在线工具 (https://sidirect2.rnai.jp/) 进行 MrSGT1 的 含有 T7 序列的特异性引物 (表 1)。利用 dsRNA 特

RNA 干扰位点预测。 异性引物，以罗氏沼虾 cDNA 为模板，PCR 扩增
免疫刺激、组织样本收集及 RNA 提取 得到干扰片段。按照 T7 RiboMAX Express RNAi
TM
为检测 MrSGT1 在健康罗氏沼虾不同组织中的分 System 试 剂 盒 合 成 dsMrSGT1 和 dsGFP， 使 用
布情况，随机挑选 18 尾健康罗氏沼虾，抽取与抗 1% 琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸蛋白检测仪检
凝剂等量的血淋巴置于 4 ℃，800×g 条件下离心 测 dsRNA 的质量和浓度。
5 min，去除上清液收集血细胞；使用无菌镊子和 随机挑选 30 尾健康罗氏沼虾，平均分为 3 组，
剪刀采集肝胰腺、鳃、肌肉、心脏、眼柄、肠道、 每个生物学重复包含 3 尾虾，共设置 3 组实验重
胃等组织，液氮速冻后置于−80 ℃ 保存。每个生 复。在实验箱暂养 2 d 后进行 RNA 干扰实验，空
物学重复包含 6 尾虾，共设置 3 组实验重复。 白对照组注射 10 µL PBS，以 dsGFP 组为实验对
在进行免疫刺激实验时，设计 3 个组别，分 照组注射 10 µL 1 μg/μL dsGFP，以 dsMrSGT1 组
别为对照组、脂多糖 (LPS) 刺激组和嗜水气单胞 为实验组注射 10 µL 1 μg/μL dsMrSGT1。在首次注
菌刺激组，每组设置 3 个平行，共 9 组。每组生 射 12 h 后，每组加强注射相同剂量的各溶液。二
物学重复包含 30 尾虾，共设置 3 组实验重复。根 次注射 12 h 后，收集各组虾的血淋巴、肝胰腺和
据实验室前期研究，嗜水气单胞菌对罗氏沼虾的 鳃组织，提取 RNA 并使用 qRT-PCR 检测干扰效
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半数致死量浓度为 1.0×10 CFU / mL，LPS 的刺激 率。待基因干扰效率检测合格后，取 30 尾健康罗
浓度为 1 µg/μL [24-25] 。对照组在罗氏沼虾第二肌节 氏沼虾分为 dsGFP+A. hydrophila 组和 dsMrSGT1+
处 肌 肉 注 射 20 µL 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 (PBS, A. hydrophila 组，按照以上方法分别进行 2 次注
pH=7.2~7.4)，LPS 刺激组肌肉注射 20 µL 浓度为 射 dsGFP 或 dsMrSGT1，12 h 后采用嗜水气单胞
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1 µg/μL 的 LPS，嗜水气单胞菌刺激组肌肉注射 菌感染刺激，感染浓度为 1.0×10 CFU/mL。在病
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20 µL 浓度为 1.0×10 CFU / mL 的嗜水气单胞菌溶 原菌刺激 6 h 后，采集各组虾血淋巴、肝胰腺和
液。分别在刺激后的 7 个时间点 (0、3、6、12、 鳃组织并提取 RNA，用于后续实验。

24、48 和 72 h) 进行取样，所有组织样本经液氮 Western blot 将组织样品加入 Western 及
速冻后转移至−80 ℃ 冰箱保存。 IP 细胞裂解液 (上海碧云天生物技术股份有限公
按照动物组织总 RNA 提取试剂盒的说明书 司) 和苯甲基磺酰氟 (PMSF) 冰上裂解 30 min 后，
提取组织样本 RNA，使用超微量核酸蛋白检测仪 4 ℃ ， 12 000 r/min 离 心 5 min 取 上 清 液 ， 按 照
TM
检 测 RNA 浓 度 和 质 量 。 按 照 PrimeScript RT BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。利用裂
reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 的 解液将各组样品调整为统一浓度后，取 80 μL 蛋
说明书，将提取的 RNA 反转录成 cDNA 置于−20 ℃ 白样液加入 20 μL 5× SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液
保存。 混匀，100 ℃ 金属浴 10 min 后，将蛋白样品使用
实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 根据待检 12 % SDS-PAGE 进行条带分离，然后将分离后的
测基因序列设计 qRT-PCR 特异性引物 (表 1)，延 条带转印至亲水聚偏二氟乙烯 (PVDF) 印迹膜，
伸因子 (EF) 为内参基因，以样本 cDNA 为模板进行 转膜完成后使用 TBS-T洗膜 3 次，每次 5 min。使
qRT-PCR，反应体系为：cDNA 2 μL，上下游引物 用 5 % 脱脂牛奶常温封闭 PVDF 膜 1 h。使用 TBS-
各 2 μL，2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL， T 洗膜后使用第一抗体兔抗 ATG5 多克隆抗体和
dd H O 4 μL。反应程序：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s； 兔抗 Beclin1 多克隆抗体(稀释比例为 1∶500) 4 ℃
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https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
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