Page 214 - 《水产学报》2026年第3期
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3 期          吕彬彬，等：SGT1      介导自噬和凋亡促进罗氏沼虾抗氧化系统抵御嗜水气单胞菌感染                                50 卷

              孵育过夜。使用         TBS-T洗膜   3  次后使用    AP  标记      明书加入反应体系：检测缓冲液                40 μL，待测样
              第二抗体     (稀释比例为     1∶1 000) 室温孵育     1 h，最      品  50 μL，Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)10 μL，37 ℃
              后使用    BCIP/NBT  碱性磷酸酯酶显色试剂盒显影                   孵育  1 h  后，使用酶标仪测定         A405，将测得的数
              并拍照保存。                                           值带入标准曲线获得样品            Caspase-3  活性数值。
                    酶活性检测  将肝胰腺组织样本用裂解缓                            将收集的血细胞使用          PBS  清洗并重悬后进行
                                                                                                   6
              冲液匀浆，4 ℃，12 000 r/min       离心  10 min，取上        细胞计数，将细胞调整到浓度为                  1×10 个/mL，
              清液，通过      BCA  蛋白定量试剂盒测量蛋白浓度，                   取  100 μL  重悬的细胞，1 000×g    离心  5 min  弃上清
              用于检测抗氧化酶活性。                                      液，加入    188 μL Annexin V-FITC  结合液重悬细胞，
                   MDA  检测试剂盒说明书配制            TBA  储存液、        加入  2 μL Mito-Tracker Red CMXRos 染色液、5 μL
              MDA  检测工作液并稀释标准品，设置不同的反应                         Annexin V-FITC  和  5 μL Hoechst 33 342  染色液后
              体系，空白对照组加入裂解液0.1 mL，标准品组                         混匀，并在室温条件下避光孵育                20 min，随后置
              加入不同浓度标准品           0.1 mL，样品组加入       0.1 mL    于冰浴中，1 000×g      离心   5 min  收集细胞，加入
              待测样品，再分别加入            MDA  检测工作液      0.2 mL。    100 μL V-FITC  结合液重悬细胞，涂片后使用荧光
              混匀后，100 ℃      加热   15 min，水浴冷却至室温，              显微镜观察荧光强度并拍照保存。使用                  ImageJ 软
              1 000×g 离心  10 min，取上清液。使用酶标仪在                   件分析荧光强度，并分析凋亡和线粒体膜电位变
              532 nm  测定吸光度并绘制标准曲线，将测得的数                       化情况。
              值带入标准曲线获得样品            MDA  含量。                       统计分析  利用         GraphPad Prism V 8.0.2  软
                   根据过氧化氢酶 (CAT) 检测试剂盒说明书配                     件对实验数据进行整理与分析，通过单因素方差
              制  250 mmol/L  过氧化氢溶液、5 mmol/L      过氧化氢         分析方法 (ANOVA) 对各组实验数据进行差异性
              溶液、显色工作液，配制空白对照反应体系：过                            分析。实验数据以平均值±标准误表示。
              氧化氢酶检测缓冲液           40 μL、250 mmol/L  过氧化
                                                                2    结果
              氢溶液    10 μL  以及  CAT  反应体系：样品        10 μL、
              过氧化氢酶检测缓冲液            30 μL、250 mmol/L  过氧        2.1    MrSGT1  的分子特征
              化氢溶液      10 μL，25 ℃  反应   5 min，加入   450 μL
                                                                   使用   PCR  扩增  MrSGT1  基因后，使用       1%  琼
              过氧化氢酶反应终止液混匀。取                 10 μL  上述已终       脂糖凝胶电泳进行验证，结果显示在泳道中呈
              止反应液并加入         40 μL  过氧化氢酶检测缓冲液混               现单一条带      (图  1)，进一步测序分析其与            SGT1
              匀，取    10 μL  加入  96  孔板并加入   200 μL  显色工作       基因序列一致，这表明成功获得了                   MrSGT1  基
              液，25 ℃   孵育   20 min。使用酶标仪测定         A 520 ，检    因的   ORF  序列。MrSGT1    基因   (GenBank  登录号
              测标准品并绘制标准曲线，根据说明书计算过氧                            PV904259) 的  ORF  为  687 bp，编码  228  个氨基酸，
              化氢酶活性。                                           蛋白相对分子质量为         25.41 ku，等电点为     5.54。预
                   根据总抗氧化能力 (T-AOC Assay Kit) 检测试              测  MrSGT1  蛋 白 含 有  CS (第  28~104 氨 基 酸 ) 和
              剂盒说明书配制所需的            FRAP  工作液，以及      0.15、    SGS (SGT1  特有结构域) (第     146~226  氨基酸)2   个

              0.3、0.6、0.9、1.2  和  1.5 mmol/L  的标准品，在    96     结 构 域 ， 无 信 号 肽     (图  2)。 序 列 分 析 显 示 ，
              孔板中加入      180 μL FRAP  工作液，分别加入         5 μL    MrSGT1  存在  N-糖基化位点       (第  4、56、159  位)、
              的  PBS  作为空白对照、5 μL       标准品、5 μL     样品，       丝 氨 酸 位 点   (第  6、 63、 70、 72、 75、 90、 96、
              混匀后    37 ℃  孵育  5 min  测定  A593，绘制标准曲           140、143、182、192、196、210      位)、苏氨酸位
              线，根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力。                             点  (第  12、35、42、58、61、130、185、199、203
                    细胞凋亡检测  根据碧云天               Caspase-3  活   位) 以及酪氨酸位点        (第  138  位) (图  2)。在本研究
              性检测试剂盒说明书检测标准品并绘制标准曲线。                           所选取的物种中进行序列分析显示                 MrSGT1  与日
              取液氮研磨后的肝胰腺组织样本，在其中加入蛋                            本沼虾 (M. nipponense) 的  SGT1  序列相似性最高，
              白裂解液后混匀，在冰浴中裂解                 5 min，低温离         为  95.61 %，与斑马鱼 (Danio rerio) 的 SGT1  序列相
              心  (4 ℃，16 000×g，15 min) 后取上清液并使用                似性最低，为       30.72 %(表  2)。多重序列比对结果
              BCA  蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，按照说                         显示，MrSGT1     的  CS  和  SGS  结构域在甲壳类动

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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