Page 203 - 《水产学报》2026年第3期
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3 期                                     水    产    学    报                                 50 卷

              于  THB  固体平板上，并于        37 ℃  温箱中过夜培养。            1.10    RT-qPCR  检测目的基因转录水平
              挑取单菌落于        THB  液体培养基中，37 ℃        摇床培
                                                                   免疫后第     1、3、7、14   和  28  天，每组随机选
              养，待细菌长至对数期，用无菌                PBS (pH=7.4) 缓     取  3  尾尼罗罗非鱼，经       MS-222 (100 mg/L) 麻醉后
              冲液洗涤     2  次后重悬，调整至所需浓度。570            尾健       无菌采集完整脾脏组织，作为              3  份生物学重复样
              康尼罗罗非鱼于标准化养殖系统               (水温   28 ℃) 中驯      本。按照总      RNA  提取试剂盒的操作说明进行组
              化  1  周后，随机分为       3  个菌株组   (GD201008-001、     织  RNA  的提取。使用反转录试剂盒将总               RNA  反
              ΔcrRNA  和  ΔcpsE) 和  1  个对照组，其中每个菌株              转录为   cDNA，使用荧光定量检测试剂盒进行                RT-
                                       4
                                            9
              组分别按照      6  个剂量   (1×10 ~1×10  CFU/尾，依次        qPCR，以管家基因       actβ 为内参，每个样本设置 3
              10  倍剂量递增) 攻毒       50 µL，每株菌每个剂量组               个平行重复孔，使用         2 −∆∆C t  法计算基因表达水平。
              30  尾鱼。对照组      30  尾鱼，注射     50 µL  无菌  PBS。
                                                                1.11    数据分析
              鱼体经    MS-222  麻醉后腹腔注射相应浓度菌液。
              攻毒后将鱼置于         28 ℃  恒温养殖系统中，每天定                    采用   GraphPad Prism 10.4.0  软件对实验数据
              时观察    2  次，持续监测      14 d，记录死亡情况。采              进行分析处理，RT-qPCR         数据使用双因素方差分
              用  GraphPad Prism 10.4.0  软件，以攻毒剂量为自             析，并采用     Fisher's 最小显著性差异      (LSD) 检验进
              变量、存活率为因变量，选择可变斜率四参数逻                            行事后多重比较，进行组间差异显著性分析。免
              辑回归模型进行剂量-反应曲线拟合计算                  LD 50 [21] 。  疫保护评价采用       Kaplan-Meier 法构建存活曲线，
                                                               通过  Gehan-Breslow-Wilcoxon  检验进行组间差异
               1.8    组织病理学观察
                                                               显著性分析。P<0.05       表示差异显著，P<0.01        表示
                   按照“半数致死量测定”中所述方法准备菌液                        差异极显著。
              和实验用尼罗罗非鱼。以             1×10  CFU/尾的攻毒剂
                                          6
                                                                2    结果
              量感染尼罗罗非鱼，感染             1 d  后无菌采集完整脑
              组织及脾脏组织，经           4%  多聚甲醛固定       24 h  后，
                                                                2.1    罗非鱼源无乳链球菌流行特征分析
              委托上海沃登生物科技有限公司完成石蜡包埋、
              切片及    H.E  染色。采用光学显微镜进行组织病理                         基于   NCBI 数据库收录的无乳链球菌完整基
              学观察，并拍照记录。                                       因组序列    (截至   2025  年  4  月  1  日)，本研究采集到

               1.9    免疫保护效力评估                                 49  株罗非鱼源无乳链球菌基因组，其中                 10  株来
                                                               自中国地区分离株。通过基于核心基因组单核苷
                   按照“半数致死量测定”中所述方法准备菌液
                                                               酸多态性    (SNP) 构建的系统发育树显示，10             株中
              和实验用尼罗罗非鱼。对于注射途径免疫，免疫
                                                               国分离株呈现典型的地域特征：9                株分离株为血
              组  (n=30) 尼罗罗非鱼腹腔注射接种            1×10  CFU/尾
                                                   6
                                                               清型  Ia 和序列型    ST7，这些菌株在系统发育树上
              的疫苗菌液，对照组            (n=30) 接种等体积的无菌
                                                               紧密聚集成一支        (自举支持率>90%，平均枝长<
              PBS。对于浸泡免疫，参考             Gao  等 [22]  的方法，先
                                                               0.001)；另有   1 株为血清型       Ib 和序列型    ST261，
              将免疫组      (n=30) 尼罗罗非鱼浸泡于          5%  浓度的
                                                               其遗传距离与其他中国分离株相距较远                  (图  1)。
              NaCl 溶液中    20 min，然后将其浸泡于由新鲜菌液
              配制的浓度为       1×10  CFU/mL  的淡水中    30 min，对       2.2    crRNA  和  cpsE  缺失对无乳链球菌荚膜形
                               6
              照组   (n=30) 浸泡于等体积的淡水中。浸泡免疫所                     成的影响
              用水均提前曝气。免疫后的罗非鱼均饲养于                     28℃          利用荚膜染色，检测了            crRNA  和  cpsE  缺失
              恒温养殖系统。于免疫后             14 d，每组随机选取       15     对无乳链球菌荚膜形成的影响。结果显示，WT
              尾尼罗罗非鱼开展攻毒试验。攻毒试验采用野                             株能够生成荚膜        (图版Ⅰ-1)，cpsE    缺失株则丧失
              生型强毒株       GD201008-001，以   1×10  CFU/尾 (10     了荚膜生成能力        (图版Ⅰ-2)，而     crRNA  缺失株仍
                                               7
              LD ) 的剂量经腹腔注射攻击免疫鱼，随后继续                          保留荚膜生成能力        (图版Ⅰ-3)。
                 50
              于  28 ℃  恒温条件下饲养观察，每天定时观察
                                                                2.3    crRNA  和  cpsE  缺失对无乳链球菌毒力的
              2  次，持续监测      14 d，记录死亡情况。相对免疫
                                                               影响
              保护率    (RPS) 的计算方法为：RPS (%) =(1−免疫组
              死亡率/对照组死亡率) × 100%。                                  对尼罗罗非鱼的攻毒试验显示，与                WT(LD =
                                                                                                        50
              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
                                                            4
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