Page 201 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 水 产 学 报 50 卷

质 入 侵 的 一 种 获 得 性 免 疫 系 统 ， CRISPR RNA 脑炎症状的濒死尼罗罗非鱼 [16] ；缺失株 ΔcrRNA
(crRNA) 指基因组上的一段重复序列，其经转录 和 ΔcpsE 为本实验室前期构建 。
[11]
加工后可与 Cas9 蛋白形成复合物，介导基因靶向
1.2 实验试剂
[7]
切割 ，该系统还具有内源性调控细菌毒力的作
THB 培养基 (HB0311-3) 购自青岛海博生物
用 [8-9] 。课题组前期研究显示，鱼源无乳链球菌
技 术 有 限 公 司 。 总 RNA 提 取 试 剂 盒 E.Z.N.A.
crRNA 缺失株 (ΔcrRNA) 对小鼠的致病力显著下
Total RNA Kit Ⅰ(R6834-02) 购自美国 Omega 生物
降，促进了细菌脂蛋白 Sag0671 的表达，增强了
科技有限公司。反转录试剂盒 HiScript Ⅱ Q RT
宿主的先天免疫反应 [10] ；而且 ΔcrRNA 的荚膜多
SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) (R223-01) 和 荧
糖 (CPS) 生成水平显著增强 。已知 CPS 是无乳
[11]
光定量检测试剂盒 (AceQ qPCR SYBR Green Mas-
链球菌血清型的主要决定因素，也是关键的毒力
ter Mix，High ROX Premixed，Q141-02) 购自南京
因子 ，其末端的唾液酸可以增强无乳链球菌免
[12]
诺唯赞生物科技股份有限公司。
[13]
疫逃逸能力 。有研究表明，CPS 具有良好的免
疫原性，以无乳链球菌 CPS 为主要成分的多糖人 1.3 实验对象
用疫苗已进入Ⅲ期临床试验 ，表明 CPS 是理想 体长 4~6 cm 的健康尼罗罗非鱼 (Oreochromis
[14]
的候选亚单位疫苗。推测 CPS 生成水平提高的弱 niloticus) 购自广东省广州市宏利水产养殖基地。
毒株 ΔcrRNA 可能具有良好的免疫效力。然而也 实验过程中严格遵守南京农业大学试验动物管理
有研究报道，CPS 合成基因缺失会显著降低无乳 规范，并按照南京农业大学试验动物管理委员会
链球菌的毒力，同时对强毒菌株的攻击提供了 和南京农业大学试验动物福利与伦理委员会制定
[15]
90.47% 的免疫保护力 。这些研究结果看似矛盾， 的规章制度执行。
为了确定 ΔcrRNA 的免疫保护效果，并探讨 CPS 1.4 实验引物
在疫苗菌株介导的免疫保护性上是否发挥作用，
本研究用于荧光定量 PCR(RT-qPCR) 检测的
本研究系统评估了 ΔcrRNA和荚膜合成基因 cpsE
免疫相关基因包括 T 细胞表面分子 CD4-1、主要
缺失株 (ΔcpsE) 对尼罗罗非鱼的致病性，并探究
组织相容性复合体Ⅱ类 β 链 (MHC Ⅱβ)、γ-干扰
了其作为弱毒活疫苗候选株的免疫保护效力。
素 (IFN-γ) 以及免疫球蛋白 M (IgM)，以 β-actin 编
1 材料与方法 码基因 (actβ) 作为内参。引物信息见表 1，由南京
擎科生物科技有限公司合成。
1.1 菌株与质粒 1.5 全基因组特征分析

野 生 型 (WT) 无 乳 链 球 菌 ， 菌 株 编 号 本研究所用无乳链球菌全基因组序列均来自
GD201008-001，分离自 2010 年广东地区具有脑膜 NCBI 数据库 (各菌株登录号详见图 1)，各菌株的

表 1 引物信息
Tab. 1 Primer information
目的基因 引物 序列(5' → 3') 长度/bp 参考文献
target genes primers sequence (5' → 3') length reference
actβ β-actin-F GCGGAATCCACGAAACCACC 121 [17]
β-actin-R CTGTCAGCGATGCCAGGGTA
CD4-1 CD4-1-F CCAAGGGAAACAGAGAAGGAAA 279 [18]
CD4-1-R AAGGGATGGTGAGAGGTGAAAC
MHC Ⅱβ MHC IIβ-F GAGGAACAAGCTCGCCATCG 106 [17]
MHC IIβ-R AGTCGTGCTCTGACCTCGAG
IFN-γ IFN-γ-F CCAACAACTCAGGCTCGCTA 100 [14]
IFN-γ-R GCGACCTTTAGCCTTTGTTTGCCT
IgM IgM-F GGATGACGAGGAAGCAGACT 122 [14]
IgM-R CATCATCCCTTTGCCACTGG

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