Page 176 - 《水产学报》2026年第3期

3 期 张天华，等：饲料中添加不同水平纳米氧化铁对黄颡鱼幼鱼肌肉发育的影响及其机理 50 卷

[14]
表 1 实验饲料组成及营养成分 (风干基础) 光谱分析 。
Tab. 1 Formulation and proximate composition of
1.4 组织学切片及 H.E 染色
the experimental diets (dry matter) %
原料/(g/kg) 对照组 低添加组 高添加组 参照 Xu 等 [14] 的方法，采用 H.E 染色进行肌
ingredients Control Low Fe 2 O 3 NPs High Fe 2 O 3 NPs
肉组织学观察，使用显微镜 (BX 53，Olympus，
鱼粉 fish meal 50 50 50
日本) 采集图像，使用 Image J 测量肌纤维参数，
酪蛋白 casein 300 300 300
包括肌纤维直径 (μm) 和密度 (个/mm )。
2
玉米蛋白粉 100 100 100
corn protein meal 1.5 谷胱甘肽、游离脂肪酸以及丙二醛含量
玉米粉 corn flours 50 50 50
测定
小麦粉 wheat flours 250 250 250
谷胱甘肽 (GSH)、游离脂肪酸 (NEFA) 以及
鱼油 fish oil 30 30 30
丙二醛 (MDA) 含量测定采用商业化试剂盒 (南京
豆油 soybean oil 30 30 30
建成生物工程研究所) 进行测定，操作参照试剂盒
氯化胆碱 5 5 5
chorine chloride
说明书进行。
卵磷脂 lecithin 1 1 1
1.6 基因表达水平分析
多维 vitamin premix 5 5 5
多矿(不加铁) 5 5 5 RNA 的提取方法参照 Invitrogen 的 Trizol 说
mineral premix
(without iron) 明书进行。通过琼脂糖凝胶电泳和 Nanodrop ND-
Ca(H 2 PO 4 ) 2 ·H 2 O 10 10 10 分光光度计
2000 (Thermo Fisher Scientific，美国)
Fe 2 O 3 NPs 0.000 0 0.037 5 0.062 5 测定总 RNA 的浓度和纯度。以提取的总 RNA 为
纤维素 cellulose 164.000 0 163.962 5 163.937 5 模板，采用 TaKaRa 反转录试剂盒合成第一链
总计 total 1 000 1 000 1 000 cDNA，然后在巢式 PCR 仪上进行反转录反应。
营养成分 proximate analysis 反应结束将产物保存于−20℃ 备用。采用实时荧
水分 moisture 4.49 4.54 4.46
光定量 PCR (qPCR) 检测肌肉组织的基因表达。本
粗蛋白 crude protein 38.94 39.27 38.67
实 验 选 用 双 内 参 ， 选 择 2 种 管 家 基 因 (rpl7 和
粗脂肪 crude lipid 9.29 9.36 9.95
ubce) 对 它 们 进 行 转 录 水 平 稳 定 性 检 测 ， 采 用
灰分 ash 2.97 2.90 2.91
2 −∆∆C t 方法计算相对表达水平 (表 2)。
Fe/(mg/kg) 22.23 44.53 61.85
1.7 蛋白提取及 Western blot 分析
机选取 6 尾黄颡鱼，取其肌肉样本得到合样，快
Western blot 分析参照相关文献中的方法 [15] 。
速冷冻于液氮中，保存于−80℃，用以测定总铁含
采用的一抗为 anti-NF-κB1(Proteintech Group，14 220-
量、总蛋白提取以及 Western blot 分析等，另取
1-AP) 和 anti-GAPDH(Proteintech Group，10 494-1-
3 尾鱼解剖取其肌肉，一部分肌肉立即放在 RNA
AP)，二抗为 HRP。最后利用 Vilber Fusion FX6
保存液中，−80℃ 保存用以进行 qPCR 分析，取 3 光谱成像系统 (Vilber Lourmat) 对蛋白条带进行可
尾冰上迅速解剖，取其肌肉，苏木精-伊红 (H.E) 视化， 使用 ECL 化学发光检测试剂盒进行显影，
染色观察组织结构、肌纤维直径和数量的变化。 并利用 Image-Pro Plus 6.0 软件对其进行定量。
1.3 常规营养成分分析以及离子含量测定 1.8 myog 和 slc7a11 启动子的克隆

水分、灰分、粗脂肪和粗蛋白水平的分析遵 黄颡鱼 myog、slc7a11 启动子的克隆和分析
[14]
循本实验室近期的方法 。即通过在 105 ℃ 下烘 参照文献 [15] 。引物均由武汉擎科生物技术有限
干样品以测定水分含量，在 550 ℃ 的马弗炉中焚 公司合成 (表 3)。克隆得到的启动子序列使用
烧饲料以分析灰分含量。采用索氏乙醚萃取法测 在线工具 MatInspector(http://www.genomatix.de/) 和
定脂肪含量，凯氏定氮法通过浓 H SO 消解来测 JASPAR(http://jaspar.genereg.net/) 预测潜在的转录
4
2
定粗蛋白含量。为了测定饲料、养殖水体和肌肉 因子结合位点 (TFBS)。采用 Clustal-W 多重比对
组织中的离子含量，采用电感耦合等离子体发射 算法对序列进行比对。

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