Page 238 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 水 产 学 报 50 卷

表 2 豚鼠气单胞菌毒力基因引物序列
Tab. 2 Primer sequences of virulence genes of A. caviae
引物名称 引物序列 (5’→3’) 目的片段大小/bp 退火温度/℃
primer name primer sequences (5’→3’) target fragment size annealing temperature
溶血素基因 F: CGGACGATTATCAGGATGG 289 62
hly
R: CAAGAACGAGTTTCAGTGGC
气溶素基因 F: CCTATGGCCTGAGCGAGAAG 431 63
aer
R: CCAGTTCCAGTCCCACCACT
细胞毒性肠毒素基因 F: AGAAGGTGACCACCACCAAGAACA 232 65
act
R: AACTGACATCGGCCTTGAACTC
细胞兴奋性肠毒素基因 F: TGACCCAGTCCTGGCACGGC 443 57
alt
R: GGTGATCGATCACCACCAGC
脂肪酶基因 F: ATCTTCTCCGACTGGTTCGG 382 63
lip
R: CCGTGCCAGGACTGGGTCTT
鞭毛蛋白基因 F: ACCCGTCTGTATCGTTTCCC 640 55
flaH
R: CGTCCAGCGAGCTGTTGAG
鞭毛蛋白基因 F: GGGACCTGCTGAGTGAAA 326 55
flgA
R: GACCGATACGGCACCTAC
热敏蛋白酶基因 F: GCTCGACGCCCAGCTCACC 387 63
eprCAI
R: GGCTCACCGCATTGGATTCG
丝氨酸胞外蛋白酶基因 F: AAGGGCTATCAGGACAAGGT 703 58
ahp
R: GGTTGCGATAGGCGGTATAG
外膜蛋白A基因 F: GACGATATCATGATGAAAATGGCTCT 1 026 58
ompA
R: GCGAAGCTTTTACTTCTGAACTTCTTG
胆固醇酰基转移酶基因 F: CTCCTGGAATCCCAAGTATCAG 237 65
gcaT
R: GGCAGGTTGAACAGCAGTATCT
ompTsx F: TTAGAAGTGGTATTTAACCA 400 65
R: ATGCAATTAAAGCAACTTGC

阴性的健康黄鳝 80 尾，分为 4 组；分离菌株培养 1.9 药物敏感性分析
至对数生长期，8 000 r/min 离心 10 min，弃掉上 生物被膜形成能力测定 取分离菌株处
清液，磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 洗涤 3 次，并以 PBS 于对数生长期的菌液和 100 μL LB 培养基加入到
重悬制成菌悬液，平板活菌计数后稀释成浓度分
96 孔微量滴定板中，28 ℃ 培养 8 h，弃培养基，
别为 2×10 、2×10 、2×10 CFU/mL 的菌悬液。采 加入 200 μL 甲醇固定 20 min；PBS 洗涤 2 次并晾
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取腹腔注射的方式对黄鳝进行攻毒，每尾黄鳝注 干，加入 150 μL 0.1% 结晶紫染色 8 min；PBS 洗
射 0.2 mL，对照组注射同等体积 PBS。观察记录 涤并晾干后加入 150 μL 冰醋酸反应 10 min，用
黄鳝的死亡情况，采用改良寇氏法计算半数致死 酶标仪测定其在 550nm 波长的吸光度值 (OD)。

量 (LD )。在无菌条件下对死亡黄鳝进行解剖， 以 LB 培养基作为空白对照，各设置 3 个重复；计算
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采集肝脏、脾脏、肾脏、肠、心脏等病变组织， 3 组重复的平均值得到 OD、OD 空白 。判定标准：
使用豚鼠气单胞菌引物进行 PCR 检测并测序；称 OD≤OD 空 白 无 生 物 被 膜 能 力 ； OD 空 白 ＜ OD≤
量病变器官重量，使用平板计数法统计脏器菌载 2OD 空白 生物被膜能力较弱；2OD 空白 ＜OD≤4OD 空白
量，分析分离菌株的组织嗜性；将病变组织以多 中等生物被膜能力；OD＞4OD 空白 生物被膜能力
聚甲醛进行固定后制备石蜡切片，在光学显微镜 较强。
下观察各组织病变情况。 药敏实验 采用 KB 法测定分离菌株的药

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