Page 237 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 谭美星，等：黄鳝致病菌豚鼠气单胞菌分离鉴定、药敏特性及其生物学分析 50 卷

表 1 黄鳝常见病原的特异性引物
Tab. 1 Specific Primers for Common Pathogens of M. albus
引物名称 引物序列(5’→3’) 目的片段大小/bp
primer name primer sequence (5’→3’) target fragment size
嗜水气单胞菌 F: GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA 685
A. hydrophilic
R: CGTGCTGGCAACAAAGGACAG
温和气单胞菌 F: AAAGGTTGGCAGCTAATATCTGTCAG 680
A. sobria
R: CGTGCTGGCAACAAAGGACAG
产碱假单胞菌 F: ACTGCTGTCGGGGATACCGACGGT 455
P. alcaligenes
R: AACTTCTTCGCCAGACCTTCGGCT
迟缓爱德华氏菌 F: CATCGTCACCATTCACAGT 494
E. tarda
R: CCTTAATCCCACCCTCATAG
豚鼠气单胞菌 F: GTGACAGCACTGGCACCGGG 206
A. caviae
R: CTCGACGAAGGCCTTGATGCCC
无乳链球菌 F: ATGGAAATGAATAAAAAGCTAC 1 320
Streptococcus agalactiae
R: TTACTTAAAGGATACGTGAACGTGG
维氏气单胞菌 F: GGGATAACTACTGGAAACGGTA 343
A. veronii
R: GTAACGTCACAGCTGGCAGT
黄鳝弹状病毒 F: GTGGCAGCAATTGACATGTTCT 833
Chinese rice-field eels rhabdovirus
R: CATATCCCATCACCTTATTGACCCT

经清洗、固定、脱水等处理后制备生物样品，在 利用试验进行生理生化鉴定，根据《伯杰氏细菌
扫描电子显微镜 (SEM) 下观察分离菌株的显微结构。 鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对分离
菌株种类进行初步鉴定。
1.5 病原菌鉴定
1.7 MLST 分析
16S rRNA 基因测序和系统发育分析 取
分离菌株的纯培养物，采用水煮法提取分离菌株 根据 MLST 官网上豚鼠气单胞菌所提供的信
基因组；以提取的基因组为模板，利用 16S rRNA 息，合成 gyrB、gltA、metG、ppsA、recA 和 grolL
基因通用引物进行基因扩增，引物序列 27F：5'- 6 对管家基因；PCR 法扩增分离菌株的管家基因，
AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'，1 492R：5'-CTAC PCR 产物测序后上传至 PubMLST 数据库进行等
GGTTACCTTGTTACGAC-3'，反应程序：95 ℃ 预 位基因分析，确定该菌 ST 型，使用 PhyloViz 软
变性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s， 件基于序列分型绘制豚鼠气单胞菌进化发育树。
38 个循环；72 ℃ 退火 10 min，4 ℃ 保存。PCR 1.8 致病性分析
产物委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行
毒力基因的检测 合成与气单胞菌相关的
测序，测序结果在 NCBI Blast 进行序列同源性比
溶血素基因 (hly)、气溶素基因 (aer)、细胞毒性肠
对分析，并使用 MEGA 软件构建系统发育树。
毒素基因 (act)、细胞兴奋性肠毒素基因 (alt)、脂
1.6 病原菌的生理生化鉴定 肪酶基因 (lip)、鞭毛蛋白基因 (flaH、flgA)、热敏

在无菌条件下，将分离菌株的纯培养物接种 蛋白酶基因 (eprCAI) 等 12 个毒力基因 (表 2) [32-37] ，
至细菌微量生化鉴定管，按照细菌微量生化鉴定 以提取的分离菌基因组作为模板，PCR 法检测分
管说明书对分离菌株的蔗糖、麦芽糖、山梨醇、 离菌株携带毒力基因的情况。
甘露醇、葡萄糖、水杨苷、木糖、乳糖、海藻糖、 溶血活性的测定 将培养至对数生长期的
棉子糖、木糖醇、3% 过氧化氢酶、硫化氢、七叶 菌液取 1 μL 点种在胰酪胨大豆羊血琼脂平板，28 ℃
苷、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、尿素酶、D-葡萄 恒温培养 18~24 h，观察菌株的溶血情况。
糖、西蒙氏枸橼酸盐、丙二酸盐、明胶、硝酸盐 人工感染实验 取特定病毒和细菌检测为

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