Page 35 - 《水产学报》2025年第12期
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何宏阳，等                                                                水产学报, 2025, 49(12): 129103

                   SETD7 (SET domain containing 7) 是一种重        FASTA  序列。使用       https://www.genome.jp/tools-
              要 的 赖 氨 酸 甲 基 转 移 酶 。 早 期 研 究 发 现 ，              bin/clustalw  网站对其进行序列比对以获取.aln
              SETD7 可通过甲基化组蛋白 H3 第 4 位的赖氨                      格式的文件。利用          snapgene 软件打开.aln    格式
                                       [7]
              酸 残 基 来 调 控 基 因 表 达 。 最 新 研 究 发 现 ，              文件查看比对结果。对获得的氨基酸序列利用
              SETD7  在低氧信号通路中发挥重要作用，能够                         NCBI 对蛋白质结构域进行预测并绘图。
              通过甲基化修饰低氧信号通路中的关键转录因
                                                                1.4    靶点选择
              子  HIF-1α  来影响其转录活性，从而在低氧应激
                                                                   在  Ensembl 网站上查找尼罗罗非鱼            setd7  基
              响应中发挥调控作用，影响生物的低氧耐受能
                 [8]
              力 。据报道，敲除斑马鱼中的                 set9  基因可以        因的编码序列       (CDS)，将其输入        chopchop  网站
                                                               (https://chopchop.cbu.uib.no/) 中，找出含有  20  个
              增强其对低氧的耐受能力，同时降低脑组织中
              细胞凋亡水平 。                                         碱基的靶点序列        GN18NGG，其中       NGG  序列为
                           [9]
                   尼罗罗非鱼       (Oreochromis niloticus) 是一种     原间隔区相邻基序          (PAM)，N    代表   T、G、C、
              热带鱼类，生长快、产量高、食性杂、抗病能                             A  中任意碱基，靶点位置必须位于外显子上。
              力强、繁殖力旺盛，是中国主要的养殖水产品                             在  chopchop  网站上选择高效率的靶点，随后利
              之一 。然而，在罗非鱼的集约化养殖以及市                             用  Ensembl Blast 对靶点的特异性进行评估，最
                   [10]
              场运输的过程中，由于鱼群密度较高，若供氧                             后使用    NCBI PrimerBlast 设计检测靶点区域特
              不足容易引发缺氧死亡，给养殖户带来经济损                             异的上下游引物。
              失。因此，本研究通过             CRISPR/Cas9  基因编辑          1.5    gRNA  的合成
              技术构建甲基转移酶基因             setd7  突变尼罗罗非鱼，
                                                                   ①使用上述引物和          gRNA  质粒模板，进行
              建立耐低氧尼罗罗非鱼品系，并初步探索其低
                                                               2 × Taq Plus Master Mix (Dye Plus) (南京诺唯赞
              氧耐受能力，对提高尼罗罗非鱼在高密度养殖
                                                               生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 ) PCR     反 应  (Bio-rad，
              和长途运输过程中耐低氧适应能力具有科学价
                                                               C1000Touch，美国)，PCR       反应条件：94℃         预
              值，并为耐低氧水产种质的培育提供新思路。
                                                               变性  3 min；94℃  变性   30 s，65℃  退火  30 s，72℃
               1    材料与方法                                      延伸  30 s，循环    35  次；72℃   终延伸   10 min。随
                                                               后于   120 V (25 min)，2%  琼脂糖凝胶电泳        (Bio-
               1.1    实验材料                                     rad，PowerPac Basic，美国) 检测      PCR  产物，使
                                                               用  DNA  纯 化 试 剂 盒   (Zymo Research， D4004，
                   实验用尼罗罗非鱼来自广西水产科学研究
                                                               美国) 进行纯化，用         RNase-Free 水溶解和洗脱，
              院国家级罗非鱼良种场            (特色淡水鱼综合试验基
                                                               最后使用     Nanodrop  检测浓度。②在        RNase-Free
              地)，并在上海海洋大学实验室鱼房进行养殖。
                                                               条件下，将上述        PCR  纯化产物利用体外转录试
              取  1  对  6  月龄，体重约为     500 g  的尼罗罗非鱼亲
                                                               剂盒   (LifeTechnologies，美国) 分别进行体外转
              鱼用于交配产卵。本研究中对尼罗罗非鱼的处
              理遵循上海海洋大学动物护理和使用委员会的                             录以获得     gRNA，转录反应参考体外转录试剂
                                                               盒说明书。
              指南，批准号为         SHOU-2021-118。
                                                                1.6    尼罗罗非鱼显微注射
               1.2    质粒来源
                                                                   本研究中尼罗罗非鱼子代由亲鱼自然受精
                   本实验所用的 Cas9 质粒和 pUC19-gRNA
                                                               获得，当雌鱼结束一次产卵后约                 30 min  将受精
              scaffold 由北京大学张博教授及熊敬维教授惠赠。
                                                               卵从雌鱼口中取出，此时受精卵处于Ⅰ细胞期，
               1.3    不同物种的系统发育分析                              将其收集在培养皿上，利用显微注射器                    (Warner

                   本研究选择尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼                           Instruments，PLI-100A，美国) 将样品注射到尼
              (O. aureus)、大口黑鲈      (Micropterus salmoides)、   罗罗非鱼受精卵Ⅰ细胞期的动物极中，样品中
              斑马鱼     (Danio rerio) 等水产经济物种和模式动                gRNA  终浓度为     150 ng/μL，Cas9  蛋白终浓度为
              物 ， 从   NCBI 数 据 库 获 取     setd7  对 应 氨 基 酸      600 ng/μL，用  RNase Free ddH O 2  补足  5 μL体系，

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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