Page 36 - 《水产学报》2025年第12期
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何宏阳，等                                                                水产学报, 2025, 49(12): 129103

              每枚受精卵注射         2 nL  样品。将注射后的鱼卵及                利用   NCBI Primer Blast 引物设计网站设计长度
              未注射的野生型         (WT) 对照组鱼卵置于9 L        水中，       为  100~200 bp  的荧光定量     PCR  引物  (表  1)。每
              用商业孵化器         (ZISS，ZET-E55，韩国) 孵化，             个反应设置      4  个复孔，并以反转录的            cDNA  为
              孵化至可以自由游动。                                       模板进行扩增       (FastStart™通用  SYBRGreen  预混
                                                               液，Roche，德国；荧光定量             PCR  仪，Roche，
               1.7    敲除突变体检测
                                                               LightCycler480Ⅱ，德国)。以      β-肌动蛋白基因做
                   随机选取受精后发育至            48 h  的已注射的胚          为内参基因进行标准化。通过               2 −∆∆C t  方法计算目
              胎和对照组未注射野生型胚胎 (各                 10 枚，1 枚/       的基因的相对表达量。所有数据均经                    Student t
              管)，用碱裂解法提取尼罗罗非鱼胚胎基因组                             检验，统计学显著性差异定义为                 P<0.05。使用
              DNA：将胚胎吸入         200 μL  体积的 PCR    小管中，
                                                               GraphPad Prism  软件制图。
              加入   30 μL 50 mmol/L NaOH 12 000 r/min  振荡离
                                                                1.9    尼罗罗非鱼低氧处理
              心  30 s，95℃   裂解   20 min，加入     3 μL 1 mol/L
              TrisHCl。每管取上清液 DNA 1 μL，5          管混   1  管，        实验选取      1  月龄幼鱼，将低氧工作站内环
              混合均匀后，吸取           1 μL  作为  DNA  模板，然后          境含氧量设定为        2%。将个体大小一致的野生型
              根据靶点设计的检测引物进行 PCR 后，用                            及基因敲除型尼罗罗非鱼分别置于盛有                    200 mL
              T7E1 核酸内切酶       (Vazyme，中国) 检测突变的               养殖水的     250 mL  锥形瓶中，随后放入低氧工作
              靶 点 ， 反 应 体 系 ： PCR  产 物      5  μL、 Reaction    站内。持续记录罗非鱼存活状态，并通过拍照
              Buffer (10×) 1.1 μL、RNase Free ddH O 4 μL，短      与视频方式进行影像采集，用于绘制生存曲线。
                                               2
              暂 振 荡 离 心 后     95℃  加 热   5  min； 梯 度 退 火       实验设置每组       5  尾鱼，重复      3  次，观察并统计
              (95~85℃，降温速率2 ℃/s；85~25℃，降温速                     低氧胁迫下尼罗罗非鱼的浮头及死亡情况。
              率  0.1 ℃/s) 直至 4℃，随后加入 0.25 μL T7E1               1.10    低氧生存曲线数据分析
              酶于   37℃  反应   30 min，2%   琼脂糖凝胶电泳检
                                                                   Kaplan Meier 曲线使用     R  软件  (v.4.2.2)“sur-
              测。将存活的注射胚胎培养至性成熟后，剪取
                                                               vminer”(v.0.4.9) 和 “survival”(v3.4.0) 软 件 包 生
              每尾注射实验鱼的部分尾鳍，用碱裂解法提取
                                                               成 [11-12] 。
              DNA  后进行    PCR  扩增和    T7E1  酶切实验，筛选
              基因敲除成功的          F  (Founder)，将  F 与野生型           2    结果
                                                0
                                0
              罗 非 鱼 外 交 得 到     F ， 对  F 进 行   PCR  扩 增 和
                                        1
                                 1
              T7E1  酶切实验，检测基因敲除突变是否种系遗                          2.1    setd7  对应氨基酸序列比对
              传。对     F  PCR  扩增产物进行纯化，纯化后进                        尼罗罗非鱼           基因       长度为    1 242 bp，
                       1
              行  TA-clone [ 宝日医生物技术          (北京) 有限公                         setd7    CDS
                                                               编码   413  个氨基酸组成的蛋白质。对尼罗罗非
              司  ] 连接，转化到       DH5α [ 生工生物工程        (上海)
                                                               鱼、奥利亚罗非鱼、大口黑鲈、斑马鱼的                     setd7
              股份有限公司        ] 中， 挑选单克隆送公司测序。
                                                               对应氨基酸序列进行           BLASTP  比对，发现序列
              对于每个胚胎扩增体系，挑选                 8  个单克隆进行          保守性很高。作为一个含             SET  结构域的赖氨酸
              测 序 。 利 用 蛋 白 质 预 测 网 站       (https://swissmo-  甲基转移酶，尼罗罗非鱼             SETD7  中也含有     1  个
              del.expasy.org/) 对缺失  23 bp  碱基的罗非鱼     setd7    SET  结构域，并且该结构域在             4  个物种之间都
              基因的蛋白质结构进行预测。                                    很保守    (图  1-a)。SETD7  蛋白的    SET  结构域位
               1.8    实时荧光定量    PCR (RT-qPCR)                  于第  251~380  位氨基酸，在第        61~168  位氨基酸
                                                               有  1  个蛋白质超级家族，敲除靶点位于第                  84~
                   取  1  月龄的野生型及       setd7 的尼罗罗非鱼
                                            +/−
                                                               91  位氨基酸的    (图  1-b)。
              幼 鱼 ， 按 照    Eastep Super Total RNA Extraction
                                                                2.2    尼罗罗非鱼   setd7  基因的敲除
              Kit 步骤对幼鱼裂解物进行总             RNA  的提取，使
              用 Nanodrop 测定浓度后将 RNA           样品 保存于               尼罗罗非鱼        setd7  基因位于   2  号染色体，
              −80℃。使用反转录试剂盒            [ 宝日医生物技术        (北     有  7  个外显子，为了达到更高的敲除效率，在
              京) 有限公司      ] 将提取的 RNA 反转录为          cDNA。      氨基酸保守区域的位于            2  号外显子上选择网站

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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