Page 38 - 《水产学报》2025年第12期

何宏阳，等 水产学报, 2025, 49(12): 129103

预测高效率、高特异性的靶点 (图 2-a)。收集部 酶切多条带，说明基因敲除成功 (图 2-b)。同时
分野生型胚胎和注射胚胎进行酶切检测，发现 将 PCR 产物送测，发现在注射胚胎靶点附近出

setd7-gRNA

exon1 exon2 exon7

target site PAM
5′-AGAGCTTAATGGGCCTGCTCAGGAGTTCGATGGCGAGGGTCA-3′
3′-TCTCGAATTACCCGGACGAGTCCTCAAGCTACCGCTCCCAGT-5′
(a)
靶点
target
bp M WT WT ko1 ko2
WT
500
400
300
200
150
100 ko
50
(b) (c)
图 2 利用 CRISPR/Cas9 系统对尼罗罗非鱼 setd7 基因进行敲除
(a) setd7 基因敲除模式图，靶点位于 2 号外显子 (exon2) 上；(b) T7E1 酶切胶图，M. marker 500，WT. 野生型，ko1、ko2. 注射敲除组；(c)
野生型和注射敲除组测序峰图，红框区域为靶点位置。
Fig. 2 Knockout of the O. niloticus setd7 gene using the CRISPR/Cas9 system
(a) map of the setd7 knockout pattern with the target site located on exon 2; (b) T7E1 zymogram, M. marker 500, WT. wild type, ko1 and ko2. injection
knockout groups; (c) sequencing peak maps of wild type and injection knockout group, the red boxed area is the target location.

现重叠峰，野生型胚胎为单一峰 (图 2-c)。 2.4 setd7 基因敲除对尼罗罗非鱼低氧耐受能
力的影响
2.3 setd7 基因种系遗传鉴定结果
将雌性 F 敲除突变体尼罗罗非鱼和雄性野 选取 1 月龄的野生型尼罗罗非鱼及 setd7 +/−
0
尼罗罗非鱼置于含氧量为 2% 的低氧工作站中
生型尼罗罗非鱼交配，随机选取 12 枚 F 胚胎，
1
进行低氧耐受能力的比较。结果显示，低氧处
通过 PCR 扩增和 T7E1 酶切实验进行单胚胎鉴
理 1.5 h 后，野生型的尼罗罗非鱼出现浮头的情
定。在 12 枚胚胎里中，有 8 枚胚胎酶切出多条
况 (图 4-c)；低氧处理 2 h 以后，野生型尼罗罗
带，说明尼罗罗非鱼 setd7 发生了可遗传的基因
非鱼出现死亡 (图 4-d)；低氧处理 2.5 h 后，野
敲除突变 (图 3)。为进一步确认突变类型，对胚
生型的尼罗罗非鱼全部死亡，而 setd7 的尼罗
+/−
胎 PCR 产物进行 TA 克隆，并分别从野生型与
罗非鱼开始出现浮头现象 (图 4-e)；低氧处理
杂合子胚胎中各挑选约 8 个单克隆进行 Sanger +/−
测序。利用在线工具对该缺失突变所导致的蛋 3.6 h 后 setd7 的尼罗罗非鱼全部死亡 (图 5)。
上述结果表明， setd7 尼罗罗非鱼较野生型低
+/−
白质结构变化进行预测，发现 23 bp 缺失引起
氧耐受能力显著增强 (P<0.000 1)。
移码突变，导致提前出现终止密码子，使得原
本全长 413 个氨基酸的 SETD7 蛋白截短为 159 3 讨论
个氨基酸，提示该蛋白功能丧失，表明罗非鱼
setd7 敲除突变体被成功构建并鉴定成功。进一 SETD7 作为一种赖氨酸甲基转移酶，可以
步利用 RT-qPCR 技术分析野生型和突变品系 甲基化多种非组蛋白底物，包括 p53、TAF10、
中 setd7 的 mRNA 水平，结果显示，突变品系 E2F1、AR、RelA 和 FOXO3a 等 [13] 。有研究显
中 setd7 的 mRNA 水平显著下降。 示， SETD7 可以将甲基转移到 hif-1α 基因中第

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