Page 31 - 《水产学报》2025年第8期

陆莉莉，等 水产学报, 2025, 49(8): 089603

表 1 本研究使用的接头和引物
Tab. 1 Adapters and primers used in this study
Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ (5-3′) EcoR Ⅰ (5-3′) 荧光 fluorescence
接头Ⅰ adapters Ⅰ GACGATGAGTCTAGAA CTCGTAGACTGCGTACC
接头Ⅱ adapters Ⅱ CGTTCTAGACTCATC AATTGGTACGCAGTCTAC
预扩引物
GATGAGTCTAGAACGGT GACTGCGTACCAATTCA
preamplification primers
选扩引物 GATGAGTCTAGAACGGTCA GACTGCGTACCAATTCACA ROX
selective amplification primers GATGAGTCTAGAACGGTGT GACTGCGTACCAATTCACG NED
GATGAGTCTAGAACGGTAG GACTGCGTACCAATTCACT FAM
GATGAGTCTAGAACGGTAT GACTGCGTACCAATTCAAG HEX
GATGAGTCTAGAACGGTGT GACTGCGTACCAATTCACA ROX
GATGAGTCTAGAACGGTAC GACTGCGTACCAATTCACG NED
GATGAGTCTAGAACGGTGT GACTGCGTACCAATTCACT FAM
GATGAGTCTAGAACGGTAT GACTGCGTACCAATTCAAC HEX
GATGAGTCTAGAACGGTAT GACTGCGTACCAATTCACA ROX
GATGAGTCTAGAACGGTGC GACTGCGTACCAATTCATC NED
GATGAGTCTAGAACGGTAT GACTGCGTACCAATTCAGG FAM
GATGAGTCTAGAACGGTAC GACTGCGTACCAATTCAAG HEX

引物 (5 µmol/L) 0.5 µL，Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ预扩引 仪检测甲基化多态性，然后使用 Gene Mapper
物 (5 µmol/L) 0.5 µL，rTaq 酶 2.5 U，10× Buffer Software V3.0 软件对获得的峰值进行扫描以及
1 µL， dNTP(2.5 µmol/L) 0.8 µL， MgCl (25 收集数据。为确保数据分析的准确性和可靠性，
2
mmol/L) 0.6 µL，加 ddH O 补足至 10 µL。PCR 实验统计了条带清晰明确且长度在
2 50~1 200 bp
反应程序：72 ℃ 2 min、94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、 的片段，将 MSAP 数据按照下述方法转换为二
72 ℃ 2 min，20 个循环，最后 60 ℃ 延伸 30 min。 进制 (01) 矩阵 。
[24]

选择性扩增反应 预扩增反应结束后， 根据扩增产物在 2 个泳道内的有无情况，
将产物平均分成两份，一份用于 1% 琼脂糖 可将带型分为三种类型，Ⅰ型表示条带在 2 个
凝胶电泳分析，另一份则用灭菌超纯水稀释 20 泳道同时出现，为非甲基化位点 (11)；Ⅱ型表
倍后用于选择性扩增，共有 12 对选择性扩增引
示在 H 泳道有条带而在 M 泳道无带，为半甲基
物，其中 EcoR Ⅰ引物 5′端带有 4 种不同的荧光
化位点 (10)；Ⅲ型表示在 H 泳道无带而在 M 泳
分子标记。选择性扩增体系为 10 µL，包括预
道有带，为全甲基化位点 (01)(图 1)。对于 H
扩增产物 1.5 µL，EcoR Ⅰ选扩引物 (5 µmol/L)
和 M 泳道均无条带出现的位点 (00)，表示信息
0.5 µL， Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ 选 扩 引 物 (5 µmol/L)
未知，可能是由于遗传多态性或超甲基化所致，
0.5 µL，rTaq 酶 2.5 U，10× Buffe 1 µL，dNTP
[25]
在后续分析中舍弃 。因此，本研究按以下公
(2.5 µmol/L) 0.8 µL，MgCl (25 mmol/L) 0.6 µL，
2
加 ddH O 2 补足至 10 µL。选择性扩增 PCR 反应 式 计 算 甲 基 化 水 平 ： (1) 全 甲 基 化 水 平 (%)=
程序：94 ℃ 变性 2 min，(第 1 轮) 94 ℃ 20 s、 Ⅲ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)；(2) 半甲基化水平 (%)=Ⅱ/(Ⅰ+
56 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，10 个循环，每个循环递 Ⅱ+Ⅲ)； (3) 总 甲 基 化 水 平 (%)=(Ⅱ+Ⅲ)/(Ⅰ+
减 1 ℃；(第 2 轮) 94 ℃ 20 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ Ⅱ+Ⅲ)。

2 min，20 个循环，最后 60 ℃ 延伸 30 min。产 1.5 数据统计与分析
物于−20 ℃ 保存。

利用 R 软件 (ver.4.3.2) 的 msap 包 (ver.1.1.8)
1.4 数据收集和条带统计 [26]
(https://github.com/anpefi/msap) 分析二倍体和
使用 ABI 3730xl (Applied Biosystems) 分析 三倍体群体不同组织间的基因组甲基化差异。

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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