Page 30 - 《水产学报》2025年第8期
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陆莉莉，等                                                                 水产学报, 2025, 49(8): 089603

              也是调控基因功能的重要方式                 [10] 。在植物中，        采集二倍体和三倍体各            20  只，取外套膜、鳃、
              多倍体化通常伴随着基因组                DNA  甲基化的变           性腺和闭壳肌       4  种组织样品，液氮速冻后转移
              异  [11-12] ，解释了三倍体枇杷        (Eriobotrya japon-   到−80 ℃  冰箱保存备用。为了进行倍性分析，
              ica) 杂种优势的形成与遗传和表观遗传结构的                          从样本中取出微量鳃组织，使用流式细胞仪
              改变密切相关 ；蕹菜             (Ipomoea aquatica) 四倍     (Beckman Coulter，美国) 进行检测。本研究获
                            [12]
              体化后发生了明显的形态变异，DNA                   甲基化可         得了中国海洋大学实验动物管理和伦理委员会
              能是基因组加倍后表型变化的重要调控过程之                             批准，实验过程中操作人员严格遵守中国海洋
              一  [13] 。在动物中，异源三倍体鲤            (Cyprinus car-   大学伦理规范，并按照中国海洋大学伦理委员
                                                        [8]
              pio) 的杂种优势形成受          DNA  甲基化的调控 ；             会制定的规章制度执行。

              Sun  等 [14]  的研究揭示了   DNA  甲基化对基因表达
                                                               1.2    基因组  DNA  的提取
              水平的调控与长牡蛎            (Crassostrea gigas) 三倍体
              不育现象之间存在关联。                                          使用常规苯酚-氯仿法提取外套膜、鳃、性
                                                                                                [22]
                   DNA  甲基化有多种检测方法，甲基化敏感                       腺和闭壳肌      4  种组织的基因组       DNA ，溶于无
              扩增多态性       (methylation sensitive amplified poly-  菌水中。使用   1%  琼脂糖凝胶电泳来检测           DNA  的
              morphism，MSAP) 技术由于其操作简单、成本                      降解程度，并借助         NanoDrop 2000  仪器  (Thermo
              低、有效且可靠等          [15]  优点而成为检测      DNA  甲      Scientific, Wilmington，美国)，对  DNA  进行浓度

              基化的常用方法之一。MSAP               技术已广泛应用             和纯度的检测，然后将          A 260 /A 28 0  比值为  1.8~2.0  的
              于多倍体动植物基因组             DNA   甲基化水平和模             DNA  样品稀释为      100 ng/µL，待后续实验使用。

              式分析，包括水稻            (Oryza sativa) 、枇杷   [12] 、  1.3    荧光甲基化敏感扩增多态性分析             (F- MSAP)
                                              [16]
                                              [18]
              长 牡 蛎    [17] 、 褐 鳟  (Salmo  trutta) 、 仿 刺 参
                                                                   F- MSAP  分析参照      Yang  等 [23]  的方法，在
              (Apostichopus  japonicus) 、 泥 鳅    (Misgurnus
                                     [19]
                                                               实验方法上稍作了优化。连接反应所用接头序
                             [2]
              anguillicaudatus) 等，这些动植物的         DNA  甲基
                                                               列、预扩增引物序列、选择性扩增引物序列及
              化程度各异，存在较大差异。
                                                               所带荧光修饰见表         1。
                   福建牡蛎      (C. angulata) 旧称葡萄牙牡蛎，
                                                                   酶切及连接反应  选用条带清晰、纯度
              是一种广泛养殖的海洋经济贝类，其主要分布
                                                               较高、浓度为       100 ng/µL  的  DNA  用于酶切反应。
              于福建、广东和广西等南方沿海地区。福建牡
                                                               酶 切 反 应 体 系 为    10 µL， 包 括 模 版    DNA(100
              蛎三倍体化后常表现出生长快、个体大、抗病
                                                               ng/µL) 1 µL，EcoR Ⅰ 2 U，Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ 2 U，10×
              性强等优点       [20-21] 。福建牡蛎人工诱导三倍体化
              后是否引起基因组          DNA  甲基化变化尚未见研究                Buffer Tango 2 µL，加  ddH O 2  补足至  10 µL。将
                                                               该体系置于      37 ℃ 4 h。
              报道。为了探讨福建牡蛎二倍体和三倍体之间
                                                                   将等体积的       10 µmol/L EcoR Ⅰ单链接头、
              的表观遗传变化，本研究采用荧光标记甲基化
                                                               100 µmol/L Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ单链接头混合后，在
              敏感扩增多态性技术            (F-MSAP) 对福建牡蛎的
                                                               94 ℃  条件下变性      5 min，置于室温环境中缓慢
              外套膜、鳃、性腺和闭壳肌等                 4  种组织进行了
                                                               冷却使单链接头结合，形成双链接头。使用                      T4
              全基因组     DNA  甲基化水平分析，旨为福建牡蛎
                                                               DNA  连 接 酶 将 双 链 接 头 连 接 到 双 酶 切 后 的
              多倍体育种中的表观遗传研究提供参考。

                                                               DNA  片段上，连接反应体系为              20 µL，包括酶
              1    材料与方法                                       切产物    10 µL，EcoR Ⅰ接头       (5 µmol/L) 1 µL，
                                                               Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ接头     (50 µmol/L) 1 µL，T4 DNA
              1.1    材料来源                                      Ligase 1 µL， 10× T4 DNA Tigase Buffer 2 µL，
                   2022  年  6  月在广东湛江育苗场采用同一批                  50% PEG 4 000 2 µL，加   ddH O 2  补足至  20 µL。
              次福建牡蛎的精子和卵子培育二倍体和三倍体                             16 ℃  连接过夜。

              牡蛎，三倍体牡蛎由细胞松弛素                  B  诱导产生，             预扩增反应  将连接产物用灭菌超纯水
              之后转移至广西钦州市三娘湾海区吊养，两群                             稀释  10  倍，用于预扩增。预扩增体系为                10 µL，
              体的繁育及养殖条件相同。于                2023  年  4  月随机     包括稀释     10  倍的连接产物      2 µL，EcoR Ⅰ预扩

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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