Page 200 - 《水产学报》2025年第8期

王玲，等 水产学报, 2025, 49(8): 089417

备抗体的特异性。 验组进行处理，收集血淋巴细胞后提取蛋白 ，
[30]

通过 Western blot 检测长牡蛎 CgLC3 蛋白的表
1.7 CBZ 刺激后 CgSVIP 在长牡蛎血淋巴细胞
达和切割情况。利用 Image J 软件 (https://imagej.
中的蛋白表达水平检测
net/ij/) 分析 CgLC3Ⅱ/CgLC3Ⅰ蛋白比值表达水平。

CBZ 是一种常用的细胞自噬诱导剂 [28-29] 。
1.11 数据分析
已有研究证实 CBZ 能够诱导长牡蛎血淋巴细
胞自噬 。参考已有方法 [28] 随机挑选 18 只长牡 所有采样实验均设置 3 个平行，所有结果
[28]
蛎分为 2 组：对照组 (DMSO) 和实验组 (DMSO+ 均以平均值±标准差 (mean±SD) 表示，采用单因
CBZ)，分别注射 100 μL 20 μmol/L DMSO 溶液 素方差分析 (One-Way ANOVA) 和 LSD 法多重
和 100 μmol/L CBZ，刺激 12 h 后收集血淋巴细 比较分析。标有不同小写字母者 (a, b, c 等) 表
胞，提取蛋白后 [30] 通过 Western blot 检测 CgS- 示组间有显著差异 (P<0.05)，两组数据间进行
VIP 的蛋白表达变化，利用 Image J 软件 (https:// 差异性分析，“*”表示 P<0.05，“**”表示 P<0.01，
imagej.net/ij/) 计算蛋白表达水平。 “***”表 示 P<0.001。 利 用 GraphPad Prism 8 软

1.8 CgSVIP RNAi 实验 件绘制统计图表。

随机挑选 27 只长牡蛎分为 3 组：Blank 组、 2 结果
对 照 组 (NC-RNAi+LPS) 以 及 实 验 组 (CgSVIP-
RNAi+LPS)，其中 Blank 组不进行任何处理， 2.1 CgSVIP 的筛选
向对照组和实验组分别注射 100 μL 20 μmol/L 为了解析长牡蛎血淋巴细胞响应 4 种 PAMPs
NC 的干扰片段和 CgSVIP 的干扰片段 12 h 后， 刺激的基因表达谱，利用团队前期已发表的
再注射 100 μL 1 mg/mL 的 LPS，刺激 12 h 后收 LPS、PGN、GLU 和 Poly(I:C) 刺激下的转录组
集血淋巴细胞，提取 RNA 后反转录为 cDNA， 数据，对长牡蛎血淋巴细胞的基因表达差异水
用于测定血淋巴细胞中 CgSVIP 和自噬相关基 平进行分析，并对 4 种 PAMPs 刺激下的基因差
因 (CgLC3、 CgP62、 CgATG5、 CgBeclin1) 的 异表达水平的平均值进行排序，前 10 位差异表

mRNA 相对表达水平。 达基因见表 2，分别为 CgSVIP (CGI_10 018 422)、

1.9 CgSVIP RNAi 和 LPS 刺激后长牡蛎血淋 CgCKS1 (CGI_10 016 542)、CgORP8 (CGI_100 195
巴细胞中自噬相关基因 mRNA 相对表达水平分析 15)、 CGI_10 004 281、 CGI_10 015 431、 CGI_10
000 031、CgSTPG2 (CGI_10 026 062)、CGI_10 004
通 过 RT-qPCR 检 测 CgSVIP RNAi 和 LPS
238、 CGI_10 010 288 和 CGI_10 000 271， 其 在
刺激后长牡蛎血淋巴细胞中 CgSVIP 和自噬相
对 照 组 中 的 FPKM 均 为 0， 而 在 4 种 PAMPs
关基因 (CgLC3、CgP62、CgATG5、CgBeclin1)
刺激 12 h 后 FPKM 出现剧烈升高，平均值分
的 mRNA 相 对 表 达 水 平 。 CgSVIP、 CgLC3、
别为 106.938、80.551、73.489、65.054、62.153、
CgP62、CgATG5、CgBeclin1 的序列信息来源
46.547、45.769、43.699、35.203 和 32.665。其
于美国国家生物技术信息中心数据库 (https://
中，CgSVIP 在 4 种 PAMPs 刺激后 FPKM 分别
www.ncbi.nlm.gov/)。 利 用 Primer Premer 5.0 软
为 29.801、 64.901、 42.054 和 290.996， FPKM
件设计引物 (表 1)，并由生工生物工程 (上海)
平均值 (106.938) 变化水平最高。
股份有限公司合成，CgEF 作为内参基因 (表 1)。
为了验证转录组数据中 4 种 PAMPs 刺激
[24]
RT-qPCR 参考已发表方法 ，采用 2 −ΔΔCt 方法计
后 CgSVIP 在长牡蛎血淋巴细胞中的表达水平
算 mRNA 相对表达水平。
变化，采用 RT-qPCR 检测 4 种 PAMPs 刺激长
1.10 CgSVIP RNAi 和 LPS 刺激后长牡蛎血淋
牡蛎 12 h 后血淋巴细胞中 CgSVIP 的 mRNA 相
巴细胞中 CgLC3 蛋白表达分析
对表达水平。结果显示，CgSVIP mRNA 相对表
随机挑选 18 只长牡蛎分为 2 组：对照组 达水平在 LPS、PGN、GLU 和 Poly(I:C) 刺激 12 h
(NC-RNAi+LPS) 和实验组 (CgSVIP-RNAi+LPS)， 后显著升高，分别为 SW 组的 2.20 (P<0.01)、
并参考“CgSVIP RNAi 实验”方法对对照组和实 1.93 (P<0.001)、1.58 (P<0.05) 和 2.24 倍 (P<0.01)

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