Page 198 - 《水产学报》2025年第8期

王玲，等 水产学报, 2025, 49(8): 089417

的养殖池中暂养 7 d，适应环境后，在靠近长牡 淋巴细胞，置于 1.5 mL 的离心管中，加入 800 μL
蛎闭壳肌的壳缘处使用电钻打直径约 1 mm 的 TRIzol 试剂，液氮速冻后存放于−80 ℃ 超低温
孔，再次暂养 7 d，用于样品处理与采集实验 。 冰箱中，用于提取 RNA。此外，本研究开展室
[23]
实验所用大肠杆菌 (Escherichia coli)Trans5α 和 外免疫刺激与采样实验，于 2023 年 3—10 月，
Transetta (DE3) 化学感受态细胞购自北京全式金 每月于辽宁省大连市长牡蛎养殖海区采集养殖
生物技术有限公司。实验所用卡马西平 (Car- 长牡蛎个体，在养殖场区进行原位刺激实验，
bamazepine，CBZ) 购自生工生物工程 (上海) 股 具体将样品分为 Vs 组和 SW 组，分别注射 100
份有限公司。灿烂弧菌为实验室保存菌株。实 μL 的灿烂弧菌和 100 μL无菌海水，于注射后 0
验所用 SPF 级雌性小鼠为 4~6 周龄，购于大连 h 和 12 h 收集血淋巴细胞，置于 1.5 mL 的离心
医科大学，实验前在动物房暂养 2 周。实验所 管中，加入 800 μL TRIzol 试剂，液氮速冻后存
用 LC3 多克隆抗体购于艾博抗 (上海) 贸易有限 放于−80 ℃ 超低温冰箱中，用于提取 RNA。

公司。所有实验均按照大连海洋大学伦理委员
1.2 RNA 的提取和 cDNA 的合成
会批准的动物伦理指南进行。
提取各组织的总 RNA 和反转录过程参考
本研究中所涉及的样品处理与采集实验包
已有方法 。最终反转录产物置于−80 ℃ 超低
[24]
括室内实验与室外实验，其中室内实验包括 4
温冰箱保存，用于后续 CgSVIP 全长 cDNA 克
项内容：①组织样品采集。随机选取 9 只长牡
隆和实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 实验。
蛎，收集血淋巴细胞，用解剖剪剪取外套膜、
肝胰腺、唇瓣、鳃、性腺和闭壳肌组织样品， 1.3 4 种 PAMPs 刺激后的转录组数据分析
置 于 1.5 mL 的 离 心 管 中 ， 加 入 800 μL TRI-
利 用 实 验 室 前 期 已 发 表 的 4 种 PAMPs
zol 试剂，液氮速冻后存放于−80 ℃ 超低温冰箱
[LPS、PGN、GLU 和 Poly(I:C)] 刺激 12 h 后的
中，用于提取 RNA。②室内 4 种 PAMPs 刺激
长牡蛎血淋巴细胞转录组数据，通过 LifeScope
实验及样品采集。随机选取一批长牡蛎，分为
(http://www.lifetechnologies.com/lifescope) 软件将
实验组 [LPS、PGN、GLU、Poly(I:C)] 和对照
数据映射至长牡蛎参考基因组 v9 中 ，利用 R
[25]
组 (SW)，其中，对实验组每只长牡蛎分别注射
包 CummeRbund 分析 RNA-seq 数据，通过每百
100 μL 1 mg/mL 的 LPS、 PGN、 GLU 和 Poly
万读段中来自于某个基因每千碱基上映射的平
(I:C)，对对照组每只长牡蛎注射 100 μL 无菌海
均读段数 (FPKM) 方法评估所有基因的表达水
水；于注射后 12 h 从每组中随机挑选 9 只长牡
平 ，以 4 种 PAMPs 刺激实验的 FPKM 平均值
[26]
蛎，抽取血淋巴于 4 ℃、800 × g 下离心 10 min
对差异表达基因进行排序。

收集血淋巴细胞，每 3 只个体混为 1 个样品，
加入 800 μL TRIzol 试剂，液氮速冻后存放于 1.4 CgSVIP 基因克隆及序列分析
−80 ℃ 超低温冰箱中，用于提取 RNA。③室内 CgSVIP (XM_034475818.1) 的序列信息来
LPS 刺激实验及样品采集。随机选取一批长牡 源于美国国家生物技术信息中心数据库 (https://
蛎，分为实验组 (LPS) 和 SW 组，分别注射 100 www.ncbi.nlm.gov/)。 利 用 Primer Premer 5.0 设
μL 1 mg/mL 的 LPS 和 100 μL 无菌海水，于注 计克隆引物 (表 1)，并由生工生物工程 (上海)
射后分别于 0、3、6、12、24、48 和 72 h 收集 股份有限公司合成。通过 Ex Taq DNA 酶 (TaKaRa，
血淋巴细胞，并置于 1.5 mL 的离心管中，加入 日本) 扩增 CgSVIP 基因，并将扩增序列连接
800 μL TRIzol 试剂，液氮速冻后存放于−80 ℃ pMD-19T 载体 (TaKaRa，日本) 中12 h，然后将
超低温冰箱中，用于提取 RNA。④室内灿烂弧 连接重组的 pMD-19T 质粒利用热激发转化至克
菌刺激实验及样品采集。随机选取一批长牡蛎， 隆感受态 Trans5α 大肠杆菌中 (TaKaRa，日本)，
分为实验组 (Vs) 和 SW 组，分别注射 100 μL 测序参考实验室已发表方法 [24] 。利用 ExPASy
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1×10 CFU/mL 的灿烂弧菌和 100 μL无菌海水， (https://web.expasy.org/compute_pi/) 软 件 分 析
于注射后 0、3、6、12、24、48 和 72 h 收集血 CgSVIP 的蛋白分子理化性质。通过 SMART

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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