Page 199 - 《水产学报》2025年第8期

王玲，等 水产学报, 2025, 49(8): 089417

表 1 实验所用引物
Tab. 1 The primers used in this study
引物 序列 (5′–3′) 用途
primer sequence (5′–3′) usage
CgSVIP-F ACGACATACTGCTCTGTGCT PCR
CgSVIP-R GGCACAAGCTCAAAAAGGCA PCR
CgSVIP-Ex-F CGCGGATCCATGGGAATTTGTCTGCCGTGT PCR
CgSVIP-Ex-R CCGCTCGAGACTAACTTGCCACCTAAGTCC PCR
CgSVIP-RT-F AACCAAGCCCTGAGACAAGG RT-qPCR
CgSVIP-RT-R CCTCCTGACTGCTCTGCTTT RT-qPCR
CgLC3-RT-F AGGAACAGCAGCTACCTATGC RT-qPCR
CgLC3-RT-R TGGAGTTCAGTGACATTCGGTT RT-qPCR
CgP62-RT-F AAGCTGCAGACAGATGGACC RT-qPCR
CgP62-RT-R CTTGGCTCTGGTCTGGATGG RT-qPCR
CgATG5-RT-F GGAGGCTGACTCACTGAAGC RT-qPCR
CgATG5-RT-R CAGAGATTGGTGGTGCCCTT RT-qPCR
CgBeclin1-RT-F AAATGCTGCTTGGGGTCAGA RT-qPCR
CgBeclin1-RT-R CGGAATCCACCAGACCCATA RT-qPCR
CgEF-RT-F AGTCACCAAGGCTGCACAGAAAG RT-qPCR
CgEF-RT-R TCCGACGTATTTCTTTGCGATGT RT-qPCR
CgSVIP-sense GGAAUUUGUCUGCCGUGUUTT RNAi
CgSVIP- antisense AACACGGCAGACAAAUUCCTT RNAi
NC-sense UUCUCCGAACGUGUCACGUTT RNAi
NC-antisense ACGUGACACGUUCGGAGAATT RNAi

(http://smart.embl-heidelberg.de/) 预 测 CgSVIP 的 定量的结果描述为每毫升血淋巴细胞中 CgS-
[14]
保守结构域。利用 Gene Doc(https://genedoc.soft- VIP 拷贝数的以 10 为底的对数 [lg(拷贝/mL)] 。

ware.informer.com/) 程序进行氨基酸多序列比对
1.6 重组 CgSVIP 蛋白的表达和纯化及其抗体
分 析 。 利 用 MEGA 6.0(https://www.megasoft- 制备
ware.net) 软件进行系统进化树分析。

使用酶切引物 CgSVIP-Ex-F 和 CgSVIP-Ex-
1.5 CgSVIP mRNA 绝对定量标准曲线制定 R(表 1)，并由生工生物工程 (上海) 股份有限公
将测序正确的连接重组 pMD-19T 质粒的 司合成，扩增 CgSVIP 的开放阅读框 (ORF) 序
Trans5α 大肠杆菌的菌液过夜培养，并利用 San- 列。克隆得到的 CgSVIP 基因片段分别连接到
Prep 柱式质粒 DNA 小量抽提试剂盒 [ 生工生物 带有 1 个 GST-tag (26 ku) 的 pGEX4T-1 表达载
工程 (上海) 股份有限公司 ] 提取质粒，使用 体上，构建重组质粒 pGEX4T-1-SVIP，将构建
Nanodrop 2000 超微量紫外可见光分光光度计测 的 重 组 质 粒 转 化 到 感 受 态 Transetta (DE3)
定提取的质粒浓度，计算标准质粒浓度的基因 (TaKaRa，日本) 中，通过 GST-tag 蛋白融合纯
拷贝数，计算公式：标准质粒浓度的基因拷贝 化系统以及亲和层析技术纯化蛋白。用 BCA 试
数 =C×6.02×10 /[(载 体 碱 基 数 +目 的 片 段 碱 基 剂盒 (Beyotime，中国) 进行浓度定量后，通过
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数)×660×10 ](C 为 1 μL 质粒浓度)。将标准质粒 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)
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按照 10 ~10 倍梯度稀释作为制定标准曲线的 分析纯化后的重组蛋白，将纯化后的重组蛋白
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RT-qPCR 的梯度 DNA 模板。构建 C 值与 CgSVIP 储存在−80 ℃。CgSVIP 多克隆抗体制备参照实
t
初始模板浓度拷贝数的对数的标准曲线，绝对 验室已发表方法 并利用 Western blot 分析所制
[27]
https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
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