Page 160 - 《水产学报》2025年第8期

何浩斌，等 水产学报, 2025, 49(8): 089614

目前关于鱼粉掺杂掺假鉴定主要以镜检法 仲恺农业工程学院动物伦理委员会批准。

为主，辅以感官检测 [11-12] ，有时需通过物理和
1.2 实验方法
化学方法对识别结果进行补充判定 。但上述
[13]
方法存在漏检率高、灵敏度低、重复性差、依 DNA 提取 取经 95% 乙醇固定后的组
织样品 50~100 mg，利用动物组织 DNA 提取试
赖个人经验等问题。后期发展的近红外光谱技
术，可通过物质在近红外波段内的光谱特性来 剂盒 [ 天根生化科技 (北京) 有限公司 ] 根据说
明书提取总基因组 DNA。采用微量紫外分光光
检测物质性质和含量，由于其快速、高效、准
度 计 分 别 测 量 260 nm 和 280 nm 处 的 吸 光 度
确等特点，也被开发用于掺假物的鉴别 [14-17] 。
但由于模型不通用，光谱数据库不完善、需要 A 26 0 和 A 280 ，以 A 260 /A 28 0 的比值确定 DNA 的纯
度并计算 DNA 浓度。
大量代表性样本等因素，制约了该技术的广泛
应用。近年来，以 DNA 为基础的 PCR 技术逐 荧光定量 PCR 扩增 根据尼罗罗非鱼基
渐成为检测源成分的主要手段，其中实时荧光 因组序列筛选获得特异性检测尼罗罗非鱼的序
PCR (RT-PCR) 技术快速简便、特异性强、灵敏 列片段，设计其扩增上游引物：5'-CCCCACTTG-
度高，无需电泳及紫外拍照等优点成为检测技 AAAGGGACTGA-3'，下游引物：5'-ATGGCTG
术研发的热点，广泛应用于饲料 [18-19] 、肉制品 [20-21] AAAGGAGGATTGA-3'， 由 生 工 生 物 工 程 (上
海) 股份有限公司合成。扩增反应体系 20 μL：Cham
和加工食品 [22-23] 的鉴定。在畜禽饲料方面，基
于 RT-PCR 技术对牛、羊、猪、鸡、马源性等 Q SYBR qPCR Master Mix (2×) 10 μL，上、下游
成分进行检测的研究已有不少报道 [24-28] ，而有关 引物 (10 μmol/L) 各 0.4 μL，DNA 模板 2.0 μL，
灭菌水 7.2 μL。反应液配置全程在冰上完成。
鱼粉中水产动物源性成分的检测鉴定暂无研究。
本研究以常见的掺杂物尼罗罗非鱼为对象， 扩增程序为 95 °C 预变性 30 s，随后 95 °C 10 s，
通过特异性引物设计，建立鱼粉中尼罗罗非鱼 60 °C 30 s，共 40 个循环。每个反应设置 3 个平
源性成分的实时荧光 PCR 检测方法，分析该检 行。根据熔解曲线结果，确定 RT-PCR 反应的
测方法的特异性、灵敏度及实用性，为后续鱼 特异性。

粉快速、高质量检测与鉴定提供借鉴与参考。 特异性实验 提取尼罗罗非鱼及其他 50

种代表性鱼类、5 种虾蟹类样品总基因组 DNA，
1 材料与方法 进 行 引 物 特 异 性 检 测 。 将 提 取 的 50 种 鱼 类
DNA 样品随机分成 5 组，每组 10 种鱼类，各

1.1 实验材料 取 10 μL 进行混合，获得 5 份混合鱼类 DNA 样
本研究所用尼罗罗非鱼及其他鱼类，包括 品。将 5 种虾蟹类样品 DNA 各取 10 μL 进行混
鲈 形 目 (Perciformes)、 鲱 形 目 (Clupeiformes)、 合，获得 1 份虾蟹类 DNA 样品，尼罗罗非鱼
鲤形目 (Cypriniformes)、鳗鲡目 (Anguilliformes)、 DNA 单独作为 1 份样品，进行 RT-PCR。根据
鲉形目 (Scorpaeniformes)、鲀形目 (Tetraodonti- RT-PCR 的循环阈 (cycle threshold，C ) 值检验
t
formes)、 鲇 形 目 (Siluriformes) 等 代 表 性 种 类 引物对不同物种扩增的特异性。

50 种 。 虾 蟹 类 包 括 罗 氏 沼 虾 (Macrobrachium 灵敏度实验 利用灭菌纯净水对尼罗罗
rosenbergii)、斑节对虾 (Penaeus monodon)、克 非 鱼 DNA 样 品 (浓 度 为 100.000 0 ng/μL) 进 行
氏原螯虾、三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus)、 10 倍系列梯度稀释，共 6 个质量浓度 (100.000 0、
锯缘青蟹 (Scylla serrata)5 种，均采购于广州市 10.000 0、1.000 0、0.100 0、0.010 0、0.001 0 ng/μL)，
水产市场。8 种鱼粉样品 (2 种国产纯鱼粉、秘 以不同稀释浓度的尼罗罗非鱼 DNA 为模板，利
鲁鱼粉、缅甸鱼粉、越南鱼粉、巴基斯坦鱼粉、 用 KPL4 基因引物进行 RT-PCR。根据 C 值确
t
日本鱼粉和超级进口鱼粉) 均为市售鱼粉。在采 定不同 DNA 浓度的检测灵敏度。

购和分装过程中避免交叉污染，样品利用 95% 模拟混合鱼粉样品检测 选取鲈形目鲹科
乙醇固定，−20 °C 保存。所有的动物实验都严 蓝圆鲹 (Decapterus maruadsi) 作为材料制备纯鱼
格按照美国国立卫生研究院制定的“实验动物护 粉，在自制鱼粉中分别掺入质量分数 50.000 0%、
理和使用指南”中的建议进行。动物实验方案由 10.000 0%、 5.000 0%、 1.000 0%、 0.500 0%、

https://www.china-fishery.cn 中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries
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