Page 150 - 《水产学报》2025年第8期
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王一凡，等                                                                 水产学报, 2025, 49(8): 089613

              T 值设计程序并进行            PCR  扩增。PCR     产物在        取  200 μL PA  贮存液到    1.5 mL  的离心管中，经
               m
              1%  的琼脂糖凝胶中进行电泳，根据                  marker 比     高纯氮气氮吹后加入            390 μL 1% NaOH，随后
              对目的条带大小并收集胶块，使用胶回收试剂                             在  75 °C  水浴锅中进行皂化。此时，用              DMEM/
              盒  [ 生工生物工程       (上海) 股份有限公司          ] 进行      F12  培养基溶解胎牛血清白蛋白            (BSA)(Equitech-
              回收。将上述胶回收产物与载体连接                   (北京全式         Bio， 美 国 )， 按 照 质 量 体 积 比 配 制 成       1%  的
              金生物技术有限公司)，转化入感受态细胞                       (北     BSA  溶液。取     39 mL 1% BSA   溶液置于      50 °C
              京全式金生物技术有限公司)。在                 37 °C  恒温培       水浴锅中预热。待脂肪酸皂化完毕后，将脂肪
              养箱中进行过夜培养，对有插入片段的阳性克                             酸加入到预热好的          1% BSA  管中，配制成浓度
              隆进行测序。                                           为  1 mmol/L  的  PA  母液。具体配制方法参考           Li

                                                               等 [16]  的研究。
                              表 1    引物序列
                                                                   本 实 验 共 需 要 配 制     PA (C16:0)， 亚 油 酸
                       Tab. 1    Sequences of the primers
                                                               (LA，C18:2n-6)，亚麻酸      (ALA，C18:3n-3)，二
                   引物                序列               用途
                  primer            sequence         usage     十碳五烯酸       (EPA，C20:5n-3) 和二十二碳六烯
               ChREBP1-CDS-F TGAGGAGGATGGTGACAACTT  克隆         酸  (DHA， C22:6n-3)  6  种 长 链 脂 肪 酸 ， 均 从
               ChREBP1-CDS-R TCACATGGGGTGTATGTTGTCC  克隆        Sigma-Aldrich (美国) 购买。用不同脂肪酸处理
               β-actin-F  GACCTGACAGACTACCTCATG     RT-qPCR    肝细胞    12 h，并以    1% BSA  为对照，每组        3  个
               β-actin-R  AGTTGAAGGTGGTCTCGTGGA     RT-qPCR    生物重复。孵育完成后，将细胞裂解，并将收
               ChREBP1-F  GAGACTCAGAGAGGAGATCCAGCT RT-qPCR     集的样品储存在−80 °C        以供后续实验使用。

               ChREBP1-R  CCCATTATAGGACTCAAACAACGG RT-qPCR
                                                               1.7    RT-qPCR

                                                                   根据    ChamQ Universal SYBR qPCR Master
              1.4    大黄鱼  ChREBP   的氨基酸序列比对和进化
                                                               Mix (南京诺唯赞生物科技股份有限公司) 试剂
              树分析
                                                               说明书中配制扩增体系并设计扩增程序，在
                   将克隆所得大黄鱼           ChREBP  的  CDS  序列
                                                               CFX96TM Real-Time System (Bio-Rad，美国) 仪
              进 行   BLAST  (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.
                                                               器上完成目的基因的定量扩增。本实验以大黄
              cgi) 比对分析；用       ORF finder (https://www.ncbi.
                                                               鱼  β-actin  作为内参基因，目的基因引物见表               1。
              nlm.nih.gov/orffinder/) 分析  ChREBP  基因的开放
                                                               此外，已对本实验中所有目的基因引物的扩增
              阅读框并翻译成氨基酸序列；使用                    DNAMAN
                                                               效率进行验证，该值均在               0.9~1.1。最后使用
              将其与其他鱼类和哺乳动物的                 ChREBP  氨基酸                            [17]
                                                                 2 −∆∆C t  法分析实验结果 。
              序列进行比对；使用           MEGA7.0  通过邻位相连法
                                                               1.8    数据分析
              构建进化树。

                                                                   使用   SPSS 19.0 (IBM，美国) 进行数据统计
              1.5    大黄鱼  ChREBP   的蛋白结构分析
                                                               分析，数值以平均值±标准误 (mean±SE) 表示。
                   使用  Expasy Protscale 在线软件   (https://www.   三组及以上数据通过单因素方差分析                  (ANOVA)，
              expasy.org/resources/Protscale) 进行  ChREBP  蛋白   随后采用     Tukey’s 检验进行多重比较。两组数
              亲/疏水性的分析；使用          TMHMM    在线软件     (http://  据之间使用独立样本           t 检验进行分析，P < 0.05
              www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 预测   ChREBP      表示在统计学上具有显著差异。实验结果图使
              蛋白的跨膜区；使用           SMART   网站预测     ChREBP      用  GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., La
              蛋白结构域       (http://smart.embl-heidelberg.de/)；使  Jolla, 美国) 软件绘制。

              用  SWISS-MODEL    网 站   (https://swissmodel.exp-
              asy.org) 构建  ChREBP  蛋白的三级结构模型。                  2    结果


              1.6    脂肪酸配制及大黄鱼肝细胞处理                            2.1    大黄鱼  ChREBP  的基因克隆及序列分析
                   以棕榈酸    (PA) 配制为例，商品化         PA (Sigma-        根据“RNA     的提取和     cDNA  的合成”部分的
              Aldrich，美国) 用乙醇稀释为          50 mg/mL  贮存液。       方法克隆得到大黄鱼           ChREBP  基因的    CDS  序列

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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