Page 149 - 《水产学报》2025年第8期
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王一凡，等                                                                 水产学报, 2025, 49(8): 089613

              多 种 哺 乳 动 物 如 鸡     (Gallus gallus domesticus)、  积 [12-13] ，严重危害鱼类的生长与健康            [13] 。结合
              鹅   (Anser  anser  domesticus)、 猪  (Sus  scrofa  ChREBP  在糖脂代谢中的重要作用，本实验以
              domesticus) 等  [2-4]  中均成功克隆得到了      ChREBP      大黄鱼为研究对象，对            ChREBP  进行克隆，分

              基因。且研究发现，ChREBP              几乎在哺乳动物             析其生物学特性、组织表达特性以及对不同油
              的所有组织中均广泛表达，其中在肝脏、脂肪                             源及脂肪源的响应，初步探究                ChREBP  在大黄
              和小肠等组织表达量较高。在高水平碳水化合                             鱼肝脏中的功能。研究结果将为理解大黄鱼肝
              物 诱 导 下 ， ChREBP      能 够 与   Max  样 蛋 白   X     脏糖脂代谢调节机制提供研究基础，并为缓解
              (Mlx) 形成异二聚体，结合在位于靶基因启动子                         鱼类糖脂代谢紊乱提供一定的理论基础。

              区的碳水化合物反应元件             (ChRE) 上，进而激活
              糖酵解和脂肪合成相关基因的转录，调控机体                             1    材料与方法

              的糖脂代谢稳态。                                         1.1    实验用鱼及样品处理
                   在哺乳动物中的研究表明，ChREBP                 与非
                                                                   本实验用大黄鱼幼鱼均养殖于福建宁德。
              酒精性脂肪肝病有着密切关系。在肥胖和存在
              胰岛素抵抗的        ob/ob  小鼠  (Mus musculus) 中，通      暂养   2  周后投喂实验室制作的鱼油组或植物油
              过  RNAi 抑制    ChREBP  表达可逆转肝脏脂肪沉                 组饲料，每天进行两次饱食投喂，连续养殖                       10
              积 。在     ob/ob  小鼠及非酒精性脂肪性肝炎患者                   周。饲料制作方式及配方表参考已有研究                     [14-15] 。
                [5]
              中的研究也均证明了            ChREBP  的抑制能够缓解             养殖实验结束时，在禁食               24 h  后用  100 mg/L
              肝脏脂肪的堆积与胰岛素抵抗的发生 。近年                             MS-222 (Sigma-Aldrich，美国) 对样本鱼进行麻
                                                  [6]
              来有研究发现，在           ChREBP  敲除的小鼠肝脏中              醉，取肝脏、肠道、肌肉、脂肪、鳃、肾脏、脾
              乙 酰 辅 酶    A  羧 化 酶  (ACC)、 脂 肪 酸 合 成 酶          脏、眼、脑、心脏组织，并将其迅速放入液氮
              (FAS)、ATP   柠檬酸裂解酶         (ACL) 等脂质合成           中，随后转移至−80 °C        冰箱中直至使用。

              相关酶的      mRNA  水平明显降低，导致其脂肪酸
                                                               1.2    RNA  的提取和  cDNA  的合成
                              [7]
              合成率降低       65% 。而在对猪脂肪细胞的研究
              中，通过基因敲除和             siRNA  敲降的方式抑制                 使用   1 mL  的  RNA Isolater Total RNA Extrac-
              ChREBP   基因表达，均可缓解高糖诱导的脂肪                        tion Reagent 试剂  (南京诺唯赞生物科技股份有
              从头合成及下调脂肪合成酶               FAS  和  ACC1  的基      限公司) 裂解适量的大黄鱼样品组织块，具体实
              因表达水平      [8-9] 。在鱼类上，关于       ChREBP  调控       验步骤参考      Yan  等 [14]  的研究。使用    Nanodrop®
              糖脂代谢的研究较少，研究主要集中在其对摄                             2000 (Thermo Fisher Scientific，美国) 超微分光光
              食的调控。Yang       等 [10]  通过体内和体外实验表明              度计检测所提取         RNA  的浓度及质量，确保其
              葡萄糖可以通过         ChREBP   调控食欲基因神经肽               A 260 /A 28 0  值在  1.8~2.0，并根据实验需求调整其
              Y (NPY)，进而调节食物的摄入。Conde‑Sie-                     浓度。
                                                                                ®
              ira 等  [11]  发现，在油酸或葡萄糖处理下，虹鳟                        根 据   HiScript II Q Select RT SuperMix for
              (Oncorhynchus mykiss) 下 丘 脑  ChREBPɑ基 因 的        qPCR (南京诺唯赞生物科技股份有限公司) 的反
              mRNA   水平降低。然而，目前在鱼类中关于                          转录试剂说明书进行          RNA  的反转录，得到克隆
              ChREBP   在糖脂代谢中的作用及其对脂肪酸的                        和实时荧光定量         PCR (RT-qPCR) 所需的     cDNA
              响应还尚不清楚。                                         模板，并保存于−20 °C，供后续实验使用。

                   大黄鱼    (Larimichthys crocea) 属于硬骨鱼纲         1.3    大黄鱼          基因        区的克隆
              的鲈形目      (Perciformes) 石首鱼科   (Sciaenidae) 黄               ChREBP        CDS
              鱼属   (Larimichthys)，是我国特有的海洋经济鱼                      以大黄鱼肝脏        cDNA  为模板，克隆引物使
              类。近年来，鱼油资源的短缺严重限制了水产                             用  Primer Premier 5.0  并根据  NCBI (https://www.
              养殖业的可持续发展。植物油来源广泛，成本                             ncbi.nlm.nih.gov/) 上 大 黄 鱼 基 因 组  ChREBP  的
              低，采用植物油替代鱼油是解决这一问题的重                             预测序列进行设计，引物序列见表                     1。根据
              要策略。然而研究表明，橄榄油、葵花油、苏                             PrimeSTAR@Max DNA Polymerase (TaKaRa，日
              子油和豆油等植物油及其中富含的油酸、亚                              本) 试剂说明书将引物、模板、酶以及                  DEPC  水
              麻酸和亚油酸等易导致鱼体肝脏脂肪异常沉                              按  20 μL  体系配比混匀，根据说明书和引物的

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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