Page 121 - 《渔业研究》2025年第5期

662 渔 业 研 究 第 47 卷

大菱鲆（Scophthalmus maximus） ，俗称多宝鱼， 的抗病性，旨在为大菱鲆高产抗病良种的培育提供
原产于欧洲，自 1992 年引入中国后，逐渐成为沿 参考。
[1]
海地区尤其是北方沿海的主要经济养殖品种 。随
1 材料与方法
着养殖业的迅猛发展和集约化程度的不断提高，大
菱鲆病害频发，尤其以细菌性疾病危害最为严重， 1.1 实验动物
一直是制约中国大菱鲆养殖业可持续发展的一大瓶 本实验所用的 8 个家系（A、B、C、D、E、F、
[2]
颈 。其中，鳗弧菌（Vibrio anguillarum）可引起 G、H 家系）大菱鲆亲本均来自烟台天源水产有限
大菱鲆的败血症，其急性感染会在 3~5 d 内造成大 公司，选同一时期性腺成熟且健康鱼繁殖家系后
[3]
量幼苗死亡，对水产养殖极其不利 。目前，鳗弧 代。在 2023 年夏季，本团队成功构建了 F1 全同胞
菌的防治方法仍然主要依赖化学药物，包括抗生 家系。各家系先在单独育苗池内进行培育，再转入
素、消毒剂等，虽然这种方法有一定的效果，但是 养殖池进行分池饲养，并对养殖池标记家系编号，
存在耐药性和药物残留的问题。疫苗免疫是防控鳗 选取 8 个家系共 480 尾大菱鲆进行实验。实验前，
弧菌感染的有效手段，但对免疫鱼的规格有要求， 各家系随机选取 6 尾，取其肾脏和脾脏组织，划线
胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptic soy agar，TSA）平板，
若幼苗规格太小，则不适合注射免疫，并且可能存
并于 28 ℃ 培养，确保大菱鲆无鳗弧菌感染。中国
在副作用。因此，通过家系选育结合现代生物技术
水产科学研究院黄海水产研究所动物实验伦理审查
培育抗病品种，是解决大菱鲆（尤其是苗期）病害
委员会批准动物实验，批准编码为 2022012。
问题的一个重要途径 。
[4]
1.2 鳗弧菌攻毒试验
在鲆鲽类抗病育种方面，日本科学家开展了牙
本实验所用的鳗弧菌（VAM003）菌株由本团
鲆（Paralichthys olivaceus）抗淋巴囊肿病毒病品
队保存鉴定。将鳗弧菌培养于 28 ℃、胰蛋白胨大
种培育的研究，通过标记牙鲆基因组中淋巴囊肿病
豆肉汤（Tryptic soy broth，TSB）培养基内。将培
毒病抗性基因筛选出抗病家系 [5-7] ；国内科研团队
养的菌液离心，根据预实验结果，使用磷酸盐缓冲
也利用自然选择和人工感染建立了抗鳗弧菌病群
生理盐水（Phosphate buffered saline，PBS）将菌液
体，筛选出牙鲆抗鳗弧菌家系 [8-10] ；之后，以牙鲆
浓度调整至半致死浓度 10 CFU/mL [14] （攻毒浓
6
抗鳗弧菌家系为亲本杂交选育出牙鲆抗迟缓爱德华
度） 。每家系随机选取 60 尾大菱鲆，采用背部肌
菌（Edwardsiella tarda）家系 [11-13] 。马爱军等 [14] 通
肉注射法，对每尾大菱鲆注射 0.1 mL 菌液，每天
过家系选育技术从 30 个大菱鲆二代选育家系中初
观察并记录各组大菱鲆的死亡情况。
步筛选出 5 个抗鳗弧菌家系；郭建丽等 [15] 采用微
1.3 免疫因子活性测定
卫 星 分 子 标 记 技 术 分 析 确 定 了 Sma-USC141 和
分别选取感染前（对照组）和感染后 24 h（根
FF0911 两个大菱鲆抗鳗弧菌微卫星位点。目前已 [14]
据前期实验 和预实验的结果，发现大菱鲆感染
报道的抗病育种研究主要是在人工感染实验后，以
鳗弧菌后的死亡时间一般发生在感染早期，高峰期
幼鱼生长性能、死亡历时和死亡率为指标，进行大 一般在 48 h 左右，在感染后 72~96 h 后趋于稳定，
菱鲆抗鳗弧菌家系选育，尚无从免疫应答方面分析
不再发生死亡。因此，选择 24 h 作为取样时间
大菱鲆抗鳗弧菌家系特征和抗病性的报道。 点）的大菱鲆，在每个时间点，对各家系随机选
因此，本研究以初步筛选的大菱鲆抗鳗弧菌家 取 5 尾，尾静脉取血后，将血液于 4 ℃ 静置 24 h，
系为基础，开展大菱鲆抗鳗弧菌病选育家系的筛 待血液分层后，分离出上层血清并−80 ℃ 保存，进
选工作，并分析免疫相关基因（il-1β、mx、nkef、 行免疫因子活性测定。
tnf-α、 il8r、 tlr5、 mhc-Ⅰ、 mhc-Ⅱ、 IgM、 tcr、 免疫因子包括血清补体 C3、LZM 和 ACP 酶
cd4 和 cd8）的表达差异；通过人工感染鳗弧菌， 活性，分别采用血清补体 C3 活性检测试剂盒、溶
比较不同家系的死亡率差异，分析幼鱼免疫因子 菌酶活性检测试剂盒和酸性磷酸酶活性检测试
[ 补体 C3、溶菌酶（Lysozyme，LZM） 和酸性磷 剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）进行
酸酶（Acid phosphatase，ACP）] 和免疫基因在感 测定。
染前后的变化量，筛选出大菱鲆抗鳗弧菌病相关 1.4 免疫基因表达变化测定
免疫基因，并从免疫应答模式角度评价筛选家系 对大菱鲆非特异性应答免疫基因（il-1β、mx、