Page 122 - 《渔业研究》2025年第5期

第 5 期 杜普贺等： 大菱鲆抗鳗弧菌急性感染家系的筛选和免疫表达分析 663

nkef、tnf-α、il8r、tlr5）和特异性免疫基因（mhc-Ⅰ、 D、F 家系攻毒组补体 C3 含量均显著高于对照组
mhc-Ⅱ、IgM、tcr、cd4、cd8）进行实时荧光定量− （P<0.05） ，说明攻毒刺激可能激活这些家系的补
聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase 体系统，促使补体 C3 大量生成或释放 [17-18] ；其余
chain reaction，qRT-PCR）检测。在感染前（对照 家系（A、B、C、E、G、H）攻毒组与对照组补
组）和感染后 24 h，分别随机捞取 5 尾各家系大菱 体 C3 含量无显著差异，推测攻毒对其补体激活效
鲆，取头肾组织，暂存放于 RNA 保存液中（Trans- 应不明显，或存在独特免疫调控机制；D、E 家系
Gen） ，随后转入−80 ℃ 保存，参考总 RNA 提取试 攻毒组补体 C3 含量均显著高于其他家系（P<0.05） ，
剂盒（TransGen）说明书提取组织的 RNA，将提 说明不同家系大菱鲆存在遗传差异（图 2a） 。攻
取的 1.0 μg 总 RNA 反转录为 cDNA（TOYOBO） ， 毒后，各家系 LZM 酶活性与对照组无显著差异
TM
以此为模板，使用 SYBR Green Realtime PCR Mas- （P>0.05） ，A、C、D 家系攻毒组 LZM 酶活性均
ter Mix 试剂盒（TOYOBO）进行 qRT-PCR 定量检 显著高于其他家系（P<0.05） ，反映出不同家系对
测。本研究所使用的引物参考 Liu 等 [16] 的研究， 攻毒的 LZM 应答存在差异，可能与家系固有免疫
以 β-actin 为内参基因，采用 2 –ΔΔCt 法计算在人工感 基础及攻毒后的免疫激活程度有关（图 2b） 。攻
染前后免疫相关基因表达的变化。 毒后，A、G 家系攻毒组 ACP 酶活性显著高于对
1.5 数据分析 照组和其他家系（P<0.05） ，提示攻毒可能诱导这
实验结果用平均值±标准差（n=5）表示，利 两个家系的 ACP 酶活性增强，或许与免疫细胞的
用 Graph Pad Prism 9.5 软件对实验数据进行 t 检验 吞噬、消化等功能激活相关 [19] ；其余家系攻毒组

并绘制图表，P<0.05 为显著性差异。
ACP 酶活性与对照组的差异不显著（P>0.05） ，
2 结果与分析 E 家系攻毒组 ACP 酶活性显著低于 B、C、D、
F 和 H 家系（P<0.05） ，说明不同家系对攻毒的
2.1 大菱鲆鳗弧菌感染实验
ACP 响应存在遗传背景差异（图 2c） 。
各家系幼鱼在攻毒后的存活率数据见图 1。在
2.3 先天性免疫应答基因表达水平检测
攻毒后第 2 天，B 家系死亡数量最高，其次是 E 家
大菱鲆感染前和感染鳗弧菌 24 h 后，先天性
系，其他家系也陆续出现死亡；感染后第 4 天，
免疫应答基因相对表达量如图 3 所示。攻毒组
B、C、D、E、F、H 家系全部死亡，A 家系和
il-1β 基因相对表达量显著高于对照组（P<0.05） ，
G 家系逐步趋于稳定；感染后第 10 天，A 家系存
且 G、F、H 家系 il-1β 基因相对表达量显著高于其
活率为 13.15%，G 家系存活率为 10.52%，其余家
他家系（P<0.05） ，说明攻毒普遍激活 il-1β 介导
系存活率均为 0%。
的炎症通路，不同家系激活程度有差异，其中
100
A 家系 E 家系 家系上调约 倍，免疫应答最强烈（图 3a） 。
20
Family A Family E G 各家系 il8r、nkef 基因相对表达量与对照组相比均
F 家系
B 家系
80
存活率/% Survival rate 60 C 家系 G 家系 无显著差异（P>0.05） ；不同家系间，E、G mx 基
Family B
Family F
家系
Family G
Family C
il8r、nkef 基因相对表达量显著低于其他家系（P<
H 家系
D 家系
Family H
Family D
家系攻毒组
0.05） （图
3b、图
3d） 。F、G
40
20 因相对表达量显著高于对照组和其他家系（P<
0.05） ，且 G 家系 mx 基因上调最明显，提示攻毒
0 仅在这两个家系中有效地激活 mx 抗病毒通路 [20-22] ；
2 4 6 8 10
时间/d Time 其他家系响应弱，提示该家系在攻毒后可能侧重抗
图 1 人工感染鳗弧菌后 8 个家系大菱鲆幼鱼生存曲线 病毒免疫通路激活，与其他家系的免疫响应方向有
Fig. 1 Survival curve of juvenile S. maximus in 8 families 别（图 3c） 。A、G、H 家系攻毒组 tlr5 基因相对
after artificial infection with V. anguillarum 表达量显著高于对照组和其他家系（P<0.05） ，其

2.2 免疫因子的活性测定 中 A 家系上调最显著，上调约 8 倍，提示攻毒主
利用试剂盒测定补体 C3 含量和 LZM、ACP 要激活这三个家系 tlr5 介导的模式识别通路，A 家
酶活性，得出 8 个家系的变化趋势，如图 2 所示。 系免疫识别应答最突出（图 3e） 。攻毒组 tnf-α 基