Page 19 - 《水产学报》2026年第2期
P. 19

2 期                                     水    产    学    报                                 50 卷

               1.8    LPS  刺激                                  (GraphPad software Inc，美国) 处理，以平均值±标
                                                               准差  (mean±SD) 表示，组间统计学差异采用方差
                               [39]
                   根据已有研究 ，每只健康中华绒螯蟹注射
                                                               分析  (ANOVA)，P <0.05   表示差异显著，P <0.01
              5 µL，1 µg/µL LPS (Sigma-Aldrich Corporation，美
                                                               表示差异极显著。
              国)，对照组注射等体积灭菌              PBS。分别在     0、1、
              3、6、9、12、24     和  48 h时采集   HPT  和血细胞样           2    结果
              品，每个时间点各取           3  只，冻存于−80 ℃，用于
              RNA  提取、反转录和        RT-qPCR (方法同“血细胞亚
                                                                2.1    EsRunx  基因克隆与序列分析
              群分离”部分)，定量检测             LPS  刺激后   EsRunx 在
                                                                   本研究获得中华绒螯蟹            EsRunx 的部分    ORF
              HPT  和血细胞中的表达情况。每组进行                3  次重复，
                                                               为  650 bp，编码   216  个氨基酸，含有一个非常保
              数据采用     2 −∆∆C t 方法计算  EsRunx 的相对表达量。
                                                               守 的  Runt 结 构 域  (图  1)。 多 重 序 列 比 对 显 示 ，
               1.9    EsRunx  双链  RNA  干扰                      EsRunx 基因编码的蛋白与节肢动物门其他物种甚
                   分别用特异性引物          EsRunx-T7-F/EsRunx-T7-    至是哺乳动物       AML1  基因所编码的蛋白具有较高
              R  和  EGFP-T7-F/ EGFP-T7-R (表  1) 扩增长度分别         的序列相似性，其中与通讯螯虾                Plrunt 基因编码
              为   650  和  362  bp  的  EsRunx 和  EGFP  (GenBank  的相关蛋白序列相似性达到             89.96% (图  2)。系统
              登 录 号 ： MN542793.1) PCR   片 段 。 利 用   in vitro   进化树显示中华绒螯蟹           EsRunx 所编码的蛋白与通
              Transcription T7 Kit 试剂盒  (TaKaRa，日本) 体外         讯螯虾   Plrunt 所编码的蛋白聚为一支          (图  3)。
              合成   EsRunx 和  EGFP  的  dsRNA。将健康的      60  只
                                                                2.2    EsRunx  的组织表达情况
              中华绒螯蟹随机分为           dsEsRunx 干扰组和     dsEGFP
                                                                   利用半定量      RT-PCR  检测  EsRunx 在中华绒螯
              阴性对照组，每组各            30  只。每只蟹注射       30 μL
                                                               蟹不同组织中的表达发现，EsRunx 基因在血细胞
              1 μg/μL  的  dsRNA。注射    0、24、48、72    和  96 h
                                                               中有特异性高表达，而在             HPT、胃、精巢、鳃、
              时分别各取      6  只实验蟹，采集      HPT  和血细胞样品，
                                                               心脏、肌肉和肝胰腺中无表达或表达不明显                   (图  4)。
              冻存于−80 ℃，用于         RNA  提取、反转录和         RT-
              qPCR (方法同“血细胞亚群分离”部分)，定量检测                        2.3    EsRunx  在不同血细胞亚群中的表达
              双链   RNA  干扰后   EsRunx 在  HPT  和血细胞中的表               利用   Percoll 密度梯度离心法分离中华绒螯
              达情况。每组进行          3  次重复，数据采用        2 −∆∆C t  方  蟹血细胞，可将血细胞主要分为两层，上层主要
              法计算    EsRunx 的相对表达量。                            包含透明细胞       (图版-1)，下层主要包含颗粒细胞

               1.10    EsRunx  双链干扰后血细胞亚群比例变化                  (图版-2)。通过     RT-qPCR  的方法检测显示        EsRunx
                                                               基因在颗粒细胞中显著高表达              (图  5)。
                   在  EsRunx 基因  RNAi 干扰最佳时间，采集血
              细胞   (方法同“血细胞亚群分离”部分)，用              4%  多聚       2.4    失血刺激对   EsRunx  在  HPT  和血细胞中表
              甲醛固定，再利用预冷的             PBS  洗涤  2  次后重悬。        达的影响
              参照已有研究       [40] ，通过流式细胞仪       (FlowSight 多        失血刺激对       EsRunx 表达影响的结果显示，
              维全景分析仪，Merck Millipore) 根据侧向散射值                  HPT  中  EsRunx 基因在失血刺激      12  和  24 h  时显著
              (SSC) 检测各类型血细胞，采集明场               (BF) 和  SSC    升高，而血细胞中        EsRunx 在失血刺激     2、6  和  12 h
              通道的测量数据以及同步获取图像信息。每个样                            时显著升高     (图  6)。
              品 收 集   30  000  个 细 胞 样 点 的 数 据 ， 经   IDEAS
                                                                2.5    LPS  刺激对  EsRunx  在  HPT  和血细胞中表
              Application  v6.1  软 件 处 理 ， 分 别 以 侧 散 强 度
                                                               达的影响
              (intensity) 和面积  (area) 为横、纵坐标做散点图，
              依据图中细胞分布情况划分细胞类群，统计分析                                通过   RT-qPCR  技术检测     LPS  刺激后   EsRunx
              EsRunx 干扰后血细胞亚群变化情况。                             在中华绒螯蟹       HPT  和血细胞中的表达情况，结果
                                                               显示，HPT    中  EsRunx 在  LPS  刺激  6～24 h时表达
               1.11    数据分析
                                                               量呈现显著升高，而血细胞中                EsRunx 在  LPS  刺
                   所 有 数 据 均 采 用    GraphPad  Prism  9.0  软 件  激  9～48 h  时表达量也出现显著升高          (图  7)。

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
                                                            4
   14   15   16   17   18   19   20   21   22   23   24