Page 17 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 水 产 学 报 50 卷

脊椎动物 和一些无脊椎动物中 [6-9] 研究表明，血 化 。甲壳动物造血的转录调控网络仍存在显著
[35]
[5]
细胞通常以多谱系方式分化。HSC 首先产生造血 的知识缺口，尤其是关键转录因子的协同作用机
祖细胞，进一步分化为谱系决定细胞，最终发育 制尚未阐明，仍需进一步探索和验证。
[36]
为各种类型成熟血细胞。甲壳动物造血也存在不 中华绒螯蟹是东南亚重要的水产养殖物种 。
同 的 发 育 分 化 谱 系 ， 如 通 讯 螯 虾 (Pacifastacus 随着养殖规模扩大，病害问题日益严重，提高其
leniusculus) 的造血组织细胞可分为 5 种类型，根 免疫力对养殖管理至关重要。血细胞作为主要免
[37]
据每种类型细胞的胞质颗粒有无和多少以及细胞 疫细胞，由造血组织分化生成 。然而，甲壳类
器发育情况等将其与循环血细胞进行对应关联， 动物造血的转录调控机制尚未阐明。本研究从中
提出血细胞分化的两条谱系：SGCs 谱系和 GCs 华绒螯蟹中鉴定出一个含有 Runt 结构域的 Runx
谱系，即 I 型细胞发育为 II 型细胞，再发育成 III 基因，命名为 EsRunx，并通过半定量反转录 PCR
和 IV 型细胞，最后产生 GCs；II 型细胞也可直接 (RT-PCR) 检测其组织表达，实时荧光定量 PCR
发育为 V 型细胞，最后产生 SGCs [10-11] 。美洲螯龙 (RT-qPCR) 检测失血和脂多糖 (LPS) 刺激后 HPT
虾 (Homarus americanus) 和 斑 节 对 虾 (Penaeus 和血细胞中 EsRunx 的表达变化，流式细胞术分
monodon) 中也发现两种血细胞谱系 [12-13] 。HCs 被 析 dsRNA干扰 EsRunx 表达后血细胞亚群比例的
[12]
认为是斑节对虾两种血细胞谱系的前体 。红螯 变化，揭示其在血细胞分化中的作用。
螯虾 (Cherax quadricarinatus) 血细胞则沿单一谱系
分化，未成熟血细胞以 SGCs 形式释放到血液循 1 材料与方法
环中，进一步发育为成熟 GCs 。
[14]
1.1 实验蟹及样品采集
HSC 的增殖与分化受到一系列保守的转录因
子 的 调 控 ， 如 GATA、 Runx、 AML1、 lozenge 实验用中华绒螯蟹购自天津王顶堤水产批发
(Lz)、 glial cell missing(Gcm) 和 FOG (friend of 市场，实验前充气暂养 2 周 (50 只/m )，水温 20～
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GATA) 家族 [15-21] 。与高等脊椎动物相比，无脊椎 22 ℃，每天喂食 2 次。暂养结束后取健康、活泼
动物造血研究较为有限，主要基于昆虫特别是黑 的个体进行实验。失血刺激实验蟹体重为 (17.27±
腹果蝇 (Drosophila melanogaster) 的研究 [6,22-23] 。黑 1.26) g，LPS 刺激实验蟹体重为 (8.20±0.99) g。本
腹果蝇造血调控的多种转录因子和信号转导途径 研究获得了天津师范大学实验动物管理和使用伦
与脊椎动物高度相似 [20,24] 。黑腹果蝇的血细胞前体 理委员会批准，实验过程中操作人员严格遵守天
表达 GATA同源物 Serpent (Srp)，浆细胞特异性表 津师范大学伦理规范，并按照天津师范大学动物
达转录因子 Gcm，晶体细胞则以 Runx 家族蛋白 实验伦理委员会制定的规章制度执行。
Lz 的表达为特征 [15,25] 。Runx 家族包含一个保守的 中华绒螯蟹血细胞采集参照已有文献 ，用注
[38]
130 个氨基酸的 Runt 结构域，哺乳动物中 Runx 射器从实验蟹第五步足基膜处抽取血淋巴，加入
家族包括 Runx1、Runx2 和 Runx3 [26-27] 。Runx1 又 等体积预冷抗凝剂 (510 mmol/L NaCl、100 mmol/L
称作急性髓系白血病 1 (AML1)，在定向造血中发 葡萄糖、200 mmol/L 柠檬酸、30 mmol/L 柠檬酸
挥重要作用 [18,28] ，通过与 CBFβ 结合形成异二聚体 钠、10 mmol/L EDTA·2Na，pH 7.3)，4 ℃ 条件下
[29]
调控造血功能 。高等动物早期造血中，HSC 起 800×g 离心 10 min，收集血细胞，解剖获取 5 只
源于表达 Runx1 的内皮细胞，随后依赖 Runx1 表 实验蟹的 HPT、胃、精巢、鳃、心脏、肌肉和肝
达分化为各谱系 [30] 。黑腹果蝇中，Runx 同源物 胰腺等组织一起冻存于−80 ℃，用于后续 RNA 提
Lz 控制原血细胞向晶体细胞分化 [31-32] ，FOG 家族 取，基因克隆和半定量 RT-PCR。
成员 U-shape (Ush) 作为负调节因子，与 Lz 竞相
1.2 总 RNA 提取和 cDNA 合成
结合 Srp，抑制晶体细胞生成，促进浆细胞生成 。
[33]
尽管 Runx 在果蝇和脊椎动物造血中的作用已被阐 利用 TRIzol (Thermo Fisher Scientific，美国)
明，但其在甲壳动物中的功能仍缺乏直接证据。 提取中华绒螯蟹各组织总 RNA。各样品分别取
另有研究显示，中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 1 μg 总 RNA 作 为 反 转 录 反 应 模 板 ， 按 照 GoS-
Ush 促进血细胞向透明细胞分化 [34] ，类似 GATA criptTM Reverse Transcription System (Promega Cor-
的蛋白 EsGLP 参与 HSC 和原血细胞的产生和分 poration，美国) 的方法进行第一链 cDNA 合成。

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