Page 18 - 《水产学报》2026年第2期

2 期 郭利荣，等：中华绒螯蟹转录因子 Runx (EsRunx) 在调控血细胞生成分化中的作用 50 卷

稀释 10 倍的 cDNA 用于之后的基因克隆、半定 LAmp Master Mix (南京诺唯赞生物科技股份有限
量 RT-PCR 和 RT-qPCR。 公司) 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，灭菌 ddH O
2
8.5 μL。PCR 扩增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，
1.3 EsRunx 基因克隆
60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20 个循环 (β-actin)/30 个循
根据中华绒螯蟹转录组信息，设计特异性引
环 (EsRunx)；72 ℃ 10 min。取 PCR 扩增产物 10 µL
物 EsRunx-F/R(表 1)，以血细胞 cDNA 为模板，进
用 1% 琼脂糖凝胶电泳分析。
行 EsRunx 基因克隆。引物由广州华大生物科技有
1.6 血细胞亚群分离
限公司合成。扩增条件为 94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，
60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。 参照已有方法 [34] 利用 Percoll 梯度离心分离中
1% 琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后与 pMD18- 华绒螯蟹血细胞亚群。使用装有等体积预冷抗凝
T 在 16 ℃ 连接，转化 DH5α 后，挑取单菌落进行 剂的注射器从实验蟹第五步足基膜处抽取等量血
测序 (苏州金唯智生物科技有限公司)。 淋巴，4 ℃，800×g 离心 10 min，弃上清液，用抗
凝剂重悬细胞后，将其加到由 和 55% (体积
30%
表 1 本研究所用引物序列
比 1∶1) Percoll (北京索莱宝科技有限公司) 组成
Tab. 1 Primers used in this study
的改良 Percoll 梯度的顶部。4 ℃，800×g 离心 40 min
引物 引物序列 (5′-3′)
primer sequence (5′-3′) 后，血细胞分成两层。每层血细胞分别用磷酸盐
EsRunx-F GCGGTAAGGGAAGTGGAA
缓冲溶液 (PBS)(136.89 mmol/L NaCl、2.67 mmol/L
EsRunx-R CCTGAGGAAAGGTGAGACGA
KCl、 8.10 mmol/L Na HPO 以 及 1.76 mmol/L
4
2
q-EsRunx -F GGGACTGTTGGTGGTCAGAG
KH PO ，pH 7.4) 洗涤 2 次，显微镜下观察鉴定，
4
2
q-EsRunx -R TCTGGTTCTTCATGACGGCC
并分别采集后进行 RNA 提取和反转录。根据诺唯
Esβ-Actin-F CCCATCTACGAGGGCTACGC
®
赞 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒的
®
Esβ-Actin -R CCTTGATGTCTCGCACGATTTCT
方法，利用特异性引物 q-EsRunx-F/R(表 1) 进行
EsRunx-T7-F GATCACTAATACGACTCACTATAGG
GATGCACCTGGGGGAGGACAT RT-qPCR，检测 EsRunx 在不同血细胞中的表达，
EsRunx-T7-R GATCACTAATACGACTCACTATAG β-actin (引物Esβ-Actin-F/R，表 1) 作为内参基因，
GGTGAACACAGGTACACAGGCCC
无 RNase 的水代替 cDNA 模版板作为阴性对照。
EGFP-T7-F GATCACTAATACGACTCACTAT
AGGGCGTGACCACCCTGACCTA RT-qPCR 反 应 体 系 (20 μL)： cDNA 1 μL， 2×
EGFP-T7-R GATCACTAATACGACTCACTATA
GGGCACCTTGATGCCGTTCTT AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix (南京诺唯赞
生物科技股份有限公司) 10 μL，上下游引物各 0.4
1.4 EsRunx 序列分析
μL，灭菌 ddH O 8.2 μL。RT-qPCR 反应程序：95 ℃
2
使用 Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/) 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。反应完
进行编码蛋白分子量和等电点预测，在线 BLAST 成后，进行熔解曲线分析，确定只有 1 个特异性
工 具 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) 对 EsRunx PCR 产物被扩增。每个实验进行 3 次重复。所得
基因进行同源比对分析，SMART(http://smart.embl- 数据应用 2 −∆∆C t (ΔΔCt =ΔCt 样品−ΔCt 对照) 法计
heidelberg.De/) 分析 EsRunx 基因编码氨基酸的结 算 EsRunx的相对表达量。
构域特征，Bioedit 软件对不同 Runx 家族蛋白进
1.7 失血刺激
行氨基酸序列比对和蛋白进化分析，MEGA7.0 软
[35]
参考已有方法 ，从每只健康中华绒螯蟹中
件构建系统进化树。
抽取 400 µL 血淋巴进行失血刺激，并在失血后 0、
1.5 EsRunx 基因组织表达检测
2、6、9、12 和 24 h 时分别采集 HPT 和血细胞，
利 用 特 异 性 引 物 q-EsRunx-F/R (表 1) 检 测 每个时间点各取 3 只，冻存于−80 ℃，用于 RNA
EsRunx 在中华绒螯蟹血细胞、HPT、胃、精巢、 提取、反转录和 RT-qPCR (方法同“血细胞亚群分
鳃、心脏、肌肉和肝胰腺等组织中的表达，β- 离”部分)，定量检测失血刺激后 EsRunx 在 HPT 和
actin (Esβ-actin-F/R，表 1) 作为内参基因。半定量 血细胞中的表达情况。每组进行 3 次重复，数据
RT-PCR 扩增体系 (25 μL)：cDNA 2 μL，2×Vazyme 采用 2 −∆∆C t 方法计算 EsRunx 的相对表达量。

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