Page 147 - 《水产学报》2026年第01期

1 期 周佳峥，等：三疣梭子蟹养殖底质恶化的表型和理化特征及其与细菌群落的相关性 50 卷

量 PCR 仪 (Roche，瑞士)。 种水平操作分类单元 (zOTUs)。使用 QIIME2 将序
列 与 Silva 数 据 库 (v123)(https://www.arb-silva.de/)
1.2 实验方法
的系统发育信息进行比对，以获得分类注释信息。
实验设置和样品采集 选取 42 只暂养后
为消除样本间测序深度不一致造成的偏差，所有
的梭子蟹，称重，重新分布到 6 个帆布池中，每 样本数据作最小深度的归一化处理，用于后续分
个帆布池 7 只，进行为期 28 d 的养殖实验，养殖 析。本研究的原始 16S rRNA 基因测序数据已上
管理同暂养，整个养殖期间不换水。采用彼得森 传至美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 序列读取
抓斗式采泥器分别于第 0、7、14、21 和 28 天从 档案 (SRA) 数据库，登录号为 PRJNA1252452。
各帆布池的四角和中央采集梭子蟹活动区沙样， 氮循环和硫循环相关功能基因表达的定量
采样深度 3 cm，单次采样面积约 0.2 m ，混合均 PCR 分析 以底质细菌基因组 DNA 为模版，
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匀后分成 6 份，每份约 80 g，分别放入无菌袋中。 以 16S rRNA 基因为内参，采用 N 循环和 S 循环
得到实验的重复数 n = 6，共获得 30 个底质样品， 相关基因的特征性引物 [22-37] (表 1) 进行 qPCR 分析。
用冰盒保存后运至实验室。把沙样先置于超声波 本研究扩增的 N 循环相关基因包括固氮酶还原酶
清洗机内超声 15 min，经 100 μm 无菌尼龙网过滤 亚基基因 (nifH)、氨单加氧酶亚基 B 基因 (amoB)、
去掉杂质后，分成 2 份。一份经 0.45 μm 孔径的 亚硝酸氧化还原酶 α 亚基基因 (nxrA)、硝酸还原
聚碳酸酯膜过滤后冷藏于 4℃，用于底质理化指 酶基因 (narG)、亚硝酸还原酶基因 (nirK1-3 和 nirS1-
标分析；另一份经 0.22 μm 孔径的聚碳酸酯膜过 3)、氧化亚氮还原酶基因 (nosZ1-2)、硝酸还原酶
基因 (napA) 和谷氨酸脱氢酶基因 (gdhA)；S 循环
滤后冻藏于–80℃，用于细菌 DNA 提取。本研究
相关基因包括异化型亚硫酸还原酶 A/B 亚基基因
获得了宁波大学实验动物伦理委员会 (IACUC) 批
(dsrA 和 dsrB) 和腺苷酸硫酸盐还原酶 A/B 亚基基
准，实验过程中操作人员严格遵守宁波大学实验
因 (aprA 和 aprB)。PCR 体系共 20 μL，包含 cDNA
动物伦理规范，并按照宁波大学实验动物伦理委
模板 2 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)10 μL，每
员会制定的规章制度执行。
个 引 物 0.2 μmol/L， ROX Reference Dye or Dye
理化指标测定 在现场采集沙样时使用美
II(50×) 0.4 μL 和 ddH O 6 μL。qPCR 反应程序设置
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国 Spectrum IQ150 土壤原位 pH 计直接测定底质 如下：95℃ 预变性 30 s 激活 DNA 聚合酶并变性
的温度和 pH。使用 YSI 便携式多参数水质分析仪 双链 DNA，95℃ 变性 5 s，60℃ 退火 30 s，共 40
紧贴池底，测定沉积物-水界面的溶解氧 (DO) 含 个循环。每个样品设置 3 次 PCR 重复。以 pMD19-
+
量。使用 HACH 试剂测定沙样滤液的 NH -N、 T 为载体，从沙样中扩增的 393 bp 细菌靶向片段，
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−
NO -N、NO -N − 和 H S 含量。分子氨 (NH ) 浓度 构建标准质粒，经 倍稀释串联得到
2 3 2 3 10 16S rRNA
根据 Bower 等 [20] 的公式计算得到。 基因标准曲线，计算标准曲线方程与 R 值。其中，
2
DNA 提取、PCR 扩增、Illumina 测序和序 根据标准曲线生成的 16S rRNA 基因拷贝数定义
列处理 用无菌剪刀剪碎滤膜，根据试剂盒说 为绝对原核微生物生物量。N 循环和 S 循环功能
明书提取底质膜样的总 DNA。经 DNA 纯化试剂 基因丰度的计算方法参照公式：
盒纯化后，采用 NanoDrop 2000 测定 DNA 浓度及 (31−C T )(10/3)
GR = 10
纯度，检测合格的 DNA 用于 PCR 扩增。采用细
式中，GR 为相对基因丰度，C 为 T qPCR 结果，
菌 通 用 引 物 对 (338F： 5'-ACTCCTAC GGGAG-
31 为检出限。
GCAGCAG-3'和 806R： 5'-GGACTACHVGGGT-
GA Fun =(GA 16S × GR Fun )/ GR 16S ，
WTCTAAT-3')PCR 扩增 16S rRNA 基因的 V3~V4
式中，GA 表示基因绝对丰度，16S 和 Fun 分别表
区 。用 1% 琼脂糖凝胶电泳和 NanoDrop 分光光 示 16S rRNA 基因和功能基因 [38-39] 。
[21]
度法分析 PCR 产物质量。将 PCR 扩增产物进行 数据分析 采用 ggplot2 包和 ggalt 包对梭
等摩尔合并，在 MiSeq 平台上进行测序。按照 子蟹的存活曲线进行可视化。采用 vegan 包计算
USEARCH 流 程 (https://www.drive5.com/usearch/) 每个样本的 Shannon 指数，并用 BH (Benjamini-
处理扩增子测序数据。简言之，将原始数据与细 Hochberg) P 值校正和 Kruskal-Wallis 检验来比较
菌标签合并，并聚类到具有 100% 序列相似性的 各 组 间 Shannon 指 数 的 统 计 差 异 。 基 于 Bray-

中国水产学会主办 sponsored by China Society of Fisheries https://www.china-fishery.cn
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