Page 166 - 《水产学报》2025年第11期
P. 166

杨锦毅，等                                                                水产学报, 2025, 49(11): 119314

                   环境   DNA (eDNA) 是指生物散落在环境中                  码变短，eDNA       宏条形码的种间差异阈值可能
              的  DNA  片段，通常来源于生物的皮肤碎屑、黏                        都比较小 。对使用的            eDNA  宏条形码进行种
                                                                        [16]
                         [1]
              液、粪便等 。近年来，eDNA              宏条形码技术引             间差异阈值的研究应当是利用                eDNA  技术进行
              起了渔业生态学家的广泛关注，并逐渐应用于                             生物多样性监测的前提条件。
              淡水鱼类多样性调查、珍稀濒危物种和外来入                                 自  2021  年  1  月  1  日开始，长江干流和重要
              侵物种检测等领域          [2-4] 。eDNA  技术较传统的渔           支流、大型通江湖泊等重点水域正式进入                     10  年
              业资源评估技术具有以下优点：①不受科研人                             禁捕期。传统的鱼类多样性研究方法采用网具
              员的主观判断影响；②避免了长期的鱼类样本                             捕捞，作为侵入式的采样方法对长江鱼类的恢
              采集，极大提高了物种监测的效率；③利用                              复具有一定程度的影响。长江禁捕后，eDNA
              eDNA  进行生物多样性监测对自然环境属于非                          技术为非侵入式的技术，对长江鱼类的恢复几
              侵入性，对监测物种及其栖息地几乎不产生影                             乎没有影响，相比网具捕捞在监测中有影响小
              响  [5-7] 。近年来  eDNA  技术已广泛应用于国内外                 的优势。但在长江流域            eDNA  的应用依旧存在
              海洋、河流多种水体的鱼类多样性研究中                     [8-14] 。  种间差异阈值不清楚、物种注释假阳性等问题。
                   作为一种新兴的水生生物多样性调查方法，                             本 研 究 使 用 遗 传 距 离 阈 值 法 分 析 不 同
              eDNA  宏条形码技术在生物多样性调查中仍存                          eDNA  宏条形码对长江鱼类的物种鉴定能力。
              在聚类阈值不确定，种类识别不清晰的问题。                             针对长江淡水鱼类多样性调查的实际需求及
              在利用    eDNA  的研究中高通量测序能够获得大                      eDNA  宏条形码技术存在的问题，旨在分析比
                                                               较主流    eDNA  宏条形码对长江鱼类分别在种间
              量的序列，通过将达到一定相似度的序列聚类
              为  OTU  后再对    OTU  进行注释。而在将序列聚                  差异阈值为      3%、2%    和  1%  的识别情况；并基
                                                               于识别情况分析多基因条形码组合在长江鱼类
              类为   OTU  和对   OTU  注释时都需要对阈值进行
                                                               多样性研究中的可行性。本研究将为后期基于
              确定，阈值法是在物种间能够形成                     barcoding
              gap  的前提下，设定一个遗传距离作为阈值，                          eDNA  宏条形码技术的长江鱼类多样性调查以
                                                               及相关研究提供基础参考资料。
              当种间遗传距离大于阈值时，则鉴定为不同物
              种。使用      COI (cytochrome oxidase Ⅰ) 基因条形         1    材料与方法
              码专业平台的        BOLD  系统默认种间差异阈值为
              3% ，而后较多利用           DNA  条形码识别物种的                1.1    长江鱼类  eDNA  序列获取
                 [15]
              研究沿用      3%  作为种间差异阈值进行物种识别。
                                                                   参考长江鱼类名录           [24] ，在  mitofish  数据库
              不同基因的扩增子长度和总平均遗传距离不同，
                                                               (http://mitofish.aori.u-tokyo.ac.jp/) 及  NCBI 数 据
              陈治等    [16]  研究发现  12S rRNA (以下简称      12S)、
                                                               库  (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 检 索 线 粒 体
              16S rRNA (以下简称      16S) 及  COI 的  eDNA  片段
                                                               DNA。优先选择来源于长江流域样品的序列，
              的种间差异阈值有差异。最早基于                  DNA  的自动
                                                               共收集    320  种鱼类的基因序列，隶属             19  目  39
              化  OTU  用于对微生物分类的研究中，微生物基
                                                               科  154  属。
              因组学界按照惯例，在              16S  序列上差异超过
                                                                   根据目前常用的         5  种鱼类   eDNA  条形码通
                                                  [17]
              3%  的细菌谱系被认为是不同的               OTU ，而真
                                                               用引物    (表  1) 扩增的位置，截取相应的扩增子
              菌群落对基因间间隔区域采用                2%  差异标准 。
                                                       [18]
                                                               序列  (不包含引物序列)。
              在鱼类序列聚类         OTU  及对   OTU  注释的步骤上，
              一部分鱼类多样性研究            [13, 19-22]  按照惯例使用  3%     1.2    遗传距离计算及层次聚类分析
              的序列差异度作为阈值进行分类。有一些研究                                 采用   clustal X [29]  对序列进行多重对位排列，
              对物种注释出现假阳性的情况做了相应的措施。                            使用   Mega 7.0 [30]  软件对基于  k2p  模型的种间遗
              例如   Andriyono  等 [23]  在注释时仅当序列一致性              传距离并生成欧式距离矩阵。基于种间遗传距
              大于    99%  时确定到种，序列一致性在                97%~      离 使 用   python  3.10.4  软 件 中 “SciPy” [31]  包 的
              98%  时确定到属，小于          97%  分类为“未知”。随            “scipy.cluster.hierarchy”模块设置为“single”模式，
              着  eDNA宏条形码扩增子的长度相对传统条形                          阈值分别设置为         0.03、0.02  和  0.01  进行单链接

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
                                                            2
   161   162   163   164   165   166   167   168   169   170   171