Page 59 - 《水产学报》2025年第6期

梁肖，等 水产学报, 2025, 49(6): 069605

基因相对表达量利用 2 −∆∆C t 法计算。所得数据均 清洗切片 10 min，重复 3 次。在室温避光环境
表示为 mean±SD，使用 SPSS 软件进行单因素 下，针对一抗物种来源滴加适量的荧光二抗稀
方差分析及 Duncan 氏多重比较，P 值<0.05 被 释 液 和 DAPI 染 液 (286 nmol/L, Sigma, 美 国 )，
认为具有统计学意义 (“*”代表 P<0.05，“**”代表 P< 孵育 2 h 后，清洗 3 次，每次 10 min。洗脱干
0.01, “***”代表 P<0.001)。采用 Primer Premier 5 净后加抗荧光淬灭剂封片，于共聚焦荧光显微
软件设计引物，所用引物序列信息见表 1。 镜 (Nikon, A1 Plus) 下观察拍照。本实验所用的一

抗信息：兔抗 VASA (1∶500, Abcam, 英国)、鼠

表 1 引物序列
抗 CTNNB1 (1∶250, Sigma, 美国)、鼠抗 DMRT1
Tab. 1 Primer sequences
(1∶100，Santa Cruz, 美国)、羊抗 FOXL2 (1∶
基因 引物(5′-3′)
gene primer (5′-3′) 500，由杭州华安生物技术有限公司制备中华
sox9 F: TTTCCGACCGCTAAAACGACAC 鳖 FOXL2 抗体)；对应的二抗信息：驴抗兔
R: CTCCGCTGACCAAAACTTAGCCC IgG594 (1∶250， Invitrogen, 美 国 )、 驴 抗 鼠
dmrt1 F: CAAGACTCTGGCTTAATTTCCCT IgG488 (1∶250， Invitrogen, 美 国 )、 驴 抗 羊
R: TTACTTCAGCACCAGTCCA IgG488 (1∶250, Invitrogen, 美国) 和驴抗鼠 IgG-
amh F: CGTGCTCTCATCTTCCTTTTCT 594 (1∶250, Invitrogen, 美国)。

R:CTGCTGCTGTTCCTCCCAT
foxl2 F: GCTCGAAGGCAGCGTAAGT 2 结果
R:CCCCTCGTATCAAATCAGACAG
为了明确 sox9 在中华鳖早期性腺分化中的
gapdh F: GGCTTTCCGTGTTCCA ACTC
具体作用，利用实验室在龟鳖体内建立的基因
R: GACAACCTGGTCCTCCGTGTATC
功能鉴定技术 [17-18] ，向第 15 期中华鳖胚胎注入
注：F为正向引物，R为反向引物。
Notes: F stands for forward primer, and R stands for reverse primer. 携带 sox9-shRNA 干扰或 sox9-OE 过表达片段的
慢病毒液，在性腺分化启动前第 16 期 (处理后
1.4 石蜡切片和苏木素-伊红 (H.E) 染色
约 36 h) 建立了高效敲低 sox9 的 ZZ 胚胎模型
将采集的中华鳖 GMCs 组织保存于 4% 多 (表达量显著降低，抑制率达 80% 以上)(图 1-a)
聚甲醛溶液 (PFA) 中，于 4 °C 下固定过夜。采 和 过 表 达 sox9 的 ZW 胚 胎 模 型 (表 达 量 提 升
用 50% 乙醇置换固定液，2 h 后置于 70% 乙醇 300% 以上)(图 1-b)，通过观察性腺分化方向以
中进行组织包埋或 4 °C 长期保存。将待包埋 及检测雌雄基因和蛋白的表达分布，开展了
GMCs 先后经 70%、80%、90%、95% 和 100% sox9 基因的功能缺失和获得研究。

的梯度乙醇进行逐级脱水、二甲苯透明处理后，
2.1 sox9 基因的功能缺失研究
进行石蜡包埋及连续切片，切片厚度设置 5~
6 μm。将烘干后的切片置于二甲苯中完全脱蜡 sox9 敲低后 ZZ 胚胎性腺的表型变化 从
组织学水平对敲低 sox9 后的 ZZ 胚胎性腺进行
后，依次经浓度由高到低的梯度乙醇渗透，后
经 H.E 染色，再脱水，使用中性树脂封片后于 性逆转分析。体视显微镜下观察发现，第 27 期
Nikon 正置显微镜 (日本) 下观察拍照。 对照组 ZZ 性腺呈短粗状 (图版Ⅰ-1)；对照组

ZW 性腺相对较长 (图版Ⅰ-4)。sox9 敲低后的
1.5 免疫荧光染色
ZZ 性腺明显变长，与雌性性腺类似(图版Ⅰ-2，
将烘干后的 GMCs 组织切片经二甲苯完全 3)。性腺切片 H.E 染色显示，第 21 期对照组
脱蜡后，依次浸入由高到低的梯度乙醇后，使 ZZ 性腺皮质区退化呈单细胞层，髓质区发达形
用抗原修复液 (0.01 mmol/L 柠檬酸钠溶液) 进行 成原始性索 (图版Ⅰ-5)；对照组 ZW 性腺皮质
样品修复，95 °C 以上维持 20 min。待切片冷却 区发育变厚，髓质区退化未见明显的索状结构
至室温后，滴加足量封闭液于组织上，室温孵 (图版Ⅰ-8)。这种雌雄性腺形态结构差异在第
育 1 h。吸去封闭液，滴加适量一抗稀释液于组 27 期更为明显 (图版Ⅰ-9，12，13，16)。sox9
织上，4 °C 孵育过夜。次日，用 PBST 洗脱液 敲低后的 ZZ 性腺髓质区呈现不同程度的退化，

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