Page 58 - 《水产学报》2025年第6期
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梁肖，等                                                                  水产学报, 2025, 49(6): 069605

              决 定 主 控 基 因    sry (sex determining region of Y  的剩余组织，用于提取基因组               DNA  以鉴定胚胎
              chromosome) 激活，从而诱导生殖嵴向睾丸分                       的遗传性别      (ZZ  或  ZW)，具体的性别鉴定方法
              化，且缺失      sox9  会导致雄性向雌性性逆转          [3-6] 。在   参照  Literman  等 [16]  的研究。本研究获得了浙江
              鸡  (Gallus domesticus) 中，Z  染色体上的主控基             万里学院实验动物管理和使用伦理委员会批准，
              因  dmrt1 (double-sex and mab-3 related transcrip-  实验过程中操作人员严格遵守浙江万里学院关
              tion factor1) 通过刺激  sox9  的表达诱导雄性发育              于实验动物使用的伦理规范，并按照浙江万里
              通路，在性腺分化的关键时期                 sox9  呈现  ZZ  性    学院伦理委员会制定的规章制度执行。

                       [7]
              腺高表达 。sox9       基因这种性别差异性表达模
                                                               1.2    sox9  慢病毒干扰和过表达载体的构建及鳖
              式在爬行动物中同样广泛存在。在一些性别决
                                                               胚感染
              定于孵化温度的         TSD (temperature- dependent sex
              determination, 温度依赖型性别决定) 爬行动物中，                     根据实验室克隆获得的中华鳖                 sox9 cDNA
              如美洲短吻鳄         (Alligator mississippiensis)、草龟   全长序列，针对其编码序列 (coding sequence，
              (Mauremys reevesii)、红耳龟   (Trachemys scripta)、   CDS) 区 域 ， 设 计 特 异 性     shRNA  序 列 ， 构 建
              太平洋丽龟        (Lepidochelys olivacea)，sox9  在雌    sox9  干扰的慢病毒载体          (LV-U6-sox9-shRNA)；
              雄孵化温度下的早期胚胎性腺中均有表达，而                             通 过  PCR  克 隆 获 得 开 放 阅 读 框     (open reading
              在温度敏感中后期或性别分化时期的雄性性腺                             frame, ORF) 全长序列     (1 464 bp)，构建过表达
              中上调表达，呈现雌雄差异                [8-12] 。红耳龟  sox9    sox9  的 慢 病 毒 载 体   (LV-EF1a-sox9-overexpres-
              的功能鉴定实验已证实该基因是                 TSD  雄性分化         sion, OE)。由上海吉玛制药技术有限公司采用
              的必需关键因子，其缺失或过表达均会导致性                             第  4  代慢病毒载体四质粒合成法生产高滴度的
                                                                                    9
              别逆转    [13] 。而  sox9  在  GSD  爬行动物睾丸分化           慢病毒浓缩液       (大于   10 个/mL  的转导单位)，载
              中的调控作用，尚未见功能验证相关报道。                              体构建及病毒液合成方法参照课题组之前发表
                   本实验以中华鳖雄性高表达基因                 sox9 [14]  为  的文章  [17-18] 。
              操纵对象，采用慢病毒载体介导的                  RNA  干扰和            中华鳖受精卵孵化至第             15  期时，通过照
              过表达技术，从组织学和分子研究水平分析了                             蛋器挑选发育良好的鳖卵，利用微量进样器向
              敲低和过表达        sox9  后性腺的性逆转情况，从而                 其注入    5 μL sox9-shRNA  或  sox9-OE  慢病毒液，
              对  sox9  基因在中华鳖早期睾丸分化中的功能进                       实验中设置空白载体对照组。注射完毕后置于
              行验证，为阐明中华鳖性别决定和分化的分子                             相同环境下继续孵化，收集第                16、21  和  27  期
              机理以及建立单性育种技术提供基础。                                胚胎，分离性腺和          (或)GMCs 分别用于       RNA  提

                                                               取和组织切片染色。

              1    材料与方法
                                                               1.3    RNA  提取和实时荧光定量       PCR (RT-qPCR)

              1.1    鳖卵孵化和样品采集                                     将采集的中华鳖性腺组织浸泡于                 TRIzol 试
                   中华鳖受精卵购自绍兴大畈水产专业合作                          剂  (Invitrogen, 美国) 中，根据操作说明提取性
              社。将产于       12 h  内的鳖卵直接裸立在孵化盘上                  腺 总  RNA， 后 使 用 逆 转 录 试 剂 盒          (K1622,
              的定位孔中，动物极朝上。孵化盘置于恒温恒                             Thermo Scientific, 美国) 合成  cDNA，用于基因
              湿孵化箱中进行孵化，设定孵化温度为                      (31.5±    mRNA  水平表达分析。以合成的             cDNA  为模板，
              0.5) °C，雾化加湿器控制湿度在             75%~85%。孵         按 如 下 比 例 配 制      12.5  μL  PCR  反 应 体 系 ：
                                                                    ®
              化过程中定期检查孵化情况，及时丢弃未受精                             SYBR  Premix (TaKaRa, 日本) 6.25 μL，上下游
              以及坏死鳖卵。实验中设置               3  个孵化箱，分别            引物各    0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH O 4.25 μL。在
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              为空白对照组，sox9         干扰组和      sox9  过表达组，        ABI 7 500 Real-time PCR  仪  (Appiled Biosystems,
              每组   600  枚鳖卵。孵化过程中，根据中华鳖胚                       美国) 上设置以下参数进行             PCR  反应：预变性
              胎发育时期图谱         [15]  在特定发育时间点进行鳖胚               95 °C 2 min；变性    95 °C 5 s，退火   58 °C 30 s，
              处理及样品采集        [ 性腺或性腺-中肾复合体          (gonad-    40  个循环。每个实验至少重复             3  次  (n≥3)。实
              mesonephros complexes, GMCs)]，同时收集胚胎             验中设空白对照，以           gapdh  为内参基因，目的

              https://www.china-fishery.cn                           中国水产学会主办    sponsored by China Society of Fisheries
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