Page 30 - 《水产学报》2025年第6期

雷丽娜，等 水产学报, 2025, 49(6): 069403

积的 PBS。每组 30 尾实验鱼，共注射 120 尾。注 属浴 10 min 后，10% SDS-PAGE 蛋白电泳。
射后 6、12、24、48 和 72 h 组织取样。每个时 根据 SDS-PAGE 结果扩大诱导培养体积，
间点每组取 5 尾实验鱼，取鳃、肠道、肝脏、 8 000 × g 离心 5 min 收集菌体，超高压破碎，
脾脏、脑、皮肤、肌肉和头肾 8 种组织，TRIzol 提取包涵体，稀释法复性包涵体形式的重组蛋
法提取总 RNA。RNA 样品置于−80 °C冻存，用 白。将复性蛋白进行浓缩、置换后，使用分子
于中国花鲈刺激实验的基因表达定量。 筛层析柱在 AKTA 仪器 (GEHEAL THCARE) 上

纯 化 蛋 白 ， SDS-PAGE 检 测 纯 化 蛋 白 。 采 用
1.6 RT-qPCR 分析
BCA 法测定纯化蛋白的浓度，−20 °C 冻存。

利用 Primer premier 5.0 设计 IgMH 和 MHCⅡ
1.8 多克隆抗体制备及蛋白质印迹 (Western
β 基因的特异性 RT-qPCR 引物 (IgM-qF/IgM-qR
blot) 检测
和 MHCⅡ β-qF/MHCⅡ β-qR) 及内参基因转录
延伸因子 (EF-1α) 的 RT-qPCR 引物 (表 1)。用 使用驯养 2 周的新西兰白兔 (Oryctolagus
已验证的 RT-qPCR 引物，制作内参基因和目标 cuniculus)(体重约 2.5 kg) 用于多克隆抗体制备。
基因的标准曲线，用于基因表达水平的定量分 免疫注射常温溶解冻存的纯化蛋白，首次免疫
®
析。然后使用 Hieff qPCR SYBR Green Master 采用完全佐剂，佐剂和抗原 1∶1(体积比) 充分
Mix (No Rox) 将上述样品进行 RT-qPCR。反应 混匀，所注射抗原的蛋白浓度为 1 mg/mL，每
体系 10 μL：cDNA 模板 3 μL，正反向引物各 只兔子注射 0.5 mL。首次免疫后分别在第 14、
0.2 μL， qPCR SYBR Green Master Mix 5 μL， 21 和 35 天进行二次免疫、三次免疫和四次免
ddH O 1.6 μL。 参 照 qPCR SYBR Green Master 疫 (二次至四次免疫采用不完全佐剂，抗原浓度
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Mix 使用说明书设置反应程序：95 °C 预变性 减半，注射量不变)。三次免疫后第 7 天进行兔
2 min；98 °C 变性 10 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 耳动脉采血检测血清抗体效价。四次免疫后第
延伸 1 min，35 个循环；72 °C 再延伸 7 min。 7 天采集 40 mL 全血制备抗血清。利用 ELISA
使用 Graphpad Prism 8.0 (Graphpad，美国) 制作 和 Western blot 技术检测所制备的血清样品。
柱状图。
将健康中国花鲈、鳜、大口黑鲈和草鱼以
1.7 原核表达载体构建和重组蛋白诱导表达与 及人工感染爱德华氏菌 12 h 的中国花鲈全血清
纯化 分别进行 50 倍稀释，稀释后的全血清样品及纯
化的目的蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-
根据中国花鲈 IgMH 和 MHCⅡ β 基因完整
PAGE)；采用半干法转膜；使用纯化的多抗作
CDS 区序列，去除信号肽区域序列，分别针对
为一抗，一抗蛋白以 1∶1 000 稀释后进行 Western
IgMH CDS 区 、 IgMHC 1- 2 区 (IgMHC 代 表 blot；利用 Odyseey CLx 成像系统成像。
1-2
®
IgMH 的 前 两 个 恒 定 区 C1 和 C2) 和 MHCⅡ β
CDS 区对应序列设计 5'端带有 Nco I 酶切位点 2 结果
及 CA 保护碱基且 3'端带有 Bam H Ⅰ酶切位点
的引物，通过 PCR、双酶切等手段将其连接至 2.1 中国花鲈 IgMH 和 MHCⅡβ cDNA 全长克
pET21d 载体上。经测序验证后，将重组质粒分 隆与序列特征
别转化入大肠杆菌 (Escherichia coli) BL21 (C )、 本 研 究 通 过 克 隆 鉴 定 获 得 了 中 国 花 鲈
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BL21 (DE ) 及 Rosetta 表达菌株，挑选阳性单克 IgMH 和 MHCⅡβ 的 cDNA 全长序列，并上传
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隆菌落，分别接种到含 100 mg/mL 氨苄青霉素 NCBI 数 据 库 (IgMH 登 录 号 ： QWX94362.1，
的液体培养基，摇床培养 (37 °C，170 r/min) 至 MHCⅡβ 登录号：AXY87851.1)。其中，中国花
OD 600 值为 0.6~0.8。将一部分菌液加入终浓度 鲈 IgMH cDNA 全长 1 977 bp，包括 49 bp 的 5'-
为 1 mmol/L IPTG 诱导，另外一部分作为对照， UTR 和 155 bp 的 3'-UTR，开放阅读框 (ORF) 预
培养 6 h。实验组和对照组分别取出 1 mL 菌液， 测编码 590 个氨基酸，预测的蛋白相对分子质
8 000 × g 离心 5 min，弃上清液，使用 PBS 缓 量 (Mw) 和理论等电点 (pI) 分别为 63.82 ku 和
冲液重悬，加入 5 ×的上样缓冲溶液，100 °C 金 6.51。IgMH 氨基酸序列包括信号肽、1 个 V 区、

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