Page 29 - 《水产学报》2025年第6期

雷丽娜，等 水产学报, 2025, 49(6): 069403

与 MHCⅡ β-F/MHCⅡ β-R(表 1) 进行 PCR 扩增， 非编码 (3'-UTR) 区分别设计引物 IgM-CF/IgM-
引物合成由苏州金唯智生物科技有限公司完成。 CR 和 MHCⅡ β-CF/MHCⅡ β-CR，使用高保真
PCR 产物依次进行琼脂糖凝胶电泳、胶回收、 酶分别扩增 IgMH 和 MHCII β 基因编码序列，
连接、转化和菌液阳检等，然后将阳性菌液送 与上述拼接的全长序列进行比较，验证拼接结
苏州金唯智生物科技有限公司测序。根据中间 果准确性。

片段测序结果设计 3'-和 5'-RACE 引物 (表 1)， 1.3 生物信息学分析
使用已制备的 RACE-PCR cDNA 模板，采用降
基于 IgMH 和 MHCⅡ β 基因的 cDNA 全长，
落 PCR 和巢式 PCR 扩增各基因 cDNA 序列的 5'-
使用 DNAMAN 6.0 软件进行氨基酸序列预测，
末端和 3'-末端 (RACE-PCR 中使用的 APG、AP、
并在 NCBI 数据库中通过 BLAST 进行鱼类同源
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UPM 和 NUP 为通用引物 )。最后根据测序结
基因验证 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。使用
果进行全长序列拼接。
BioEdit 从 基 因 组 序 列 预 测 转 录 本 ， Ensembl
在 2 个基因的 5'-非编码区 (5'-UTR) 和 3'-
(http://asia.ensembl.org/index.htmL) 网页查找其他

表 1 实验用引物 物种基因结构。SMART (http://SMART.embl-hei-
Tab. 1 Primers used in the experiments delberg.de/) 预测 IgMH 和 MHCII β 氨基酸序列
的结构域，ExPASy (https://www.expasy.org/) 预
序号 名称 序列(5'-3')
no. name sequence (5'-3') 测信号肽、跨膜区、N-糖基化位点、分子质量
1 IgM-F CAGAAGAGCTCACATCAGTTC
和等电点 (pI)。使用 MEGA 5.1 Beta4 软件进行
2 IgM-R GCCTTGCACGTTTCAGGGATG
氨基酸多序列比对，GeneDoc 2.7 软件阴影处理
3 IgM-5'R1 CAGTCAAAGAATAACCAGAGACC
CG 比对结果。使用 MEGA5.0 软件包，采用邻接
4 IgM-5'R2 ATACTGTTCACACAGGATCCAGCT 法 (Neighbour Joining, NJ) 构建分子系统进化树，
GC
经过 10 000 次自举检验得到进化树各分支的支
5 IgM-3'F1 CAGTTGTCACTCAGCCTCAAGCA
持值。
6 IgM-3'F2 CAGGTCTATCGGGTCCAGAAC
7 IgM-CF CAGAAGAGCTCACATCAGTTC 1.4 组织表达模板制备
8 IgM-CR GTGTCGCTGTGTCTTTTGCTG
随机选取 6 尾健康的中国花鲈，用间氨基
9 IgM-qF AAAGGCACAGTGGAGGACAG
苯甲酸乙酯甲磺酸盐 (MS-222) 麻醉，尾静脉取
10 IgM-qR GTCTTGGCTTGTTGATGATG
血后解剖鱼体，分别取鳃、肠道、肝脏、脾脏、
11 MHCⅡ β-F ATGGCTTCATCCTTTCTCAG
头肾、皮肤、肌肉 (白肌) 和脑组织样品，提取
12 MHCⅡ β-R AGCCTGAGAGAACCTCTGAT
总 RNA。 按 照 Hifair™Ⅱ1st Strand cDNA Syn-
13 MHCⅡ β-5'R1 CTCCGTACTCCGTGAATCCAA
thesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) 试
14 MHCⅡ β-5'R2 GTCGTTCAGCTCAGTGGAGTTA
剂盒说明书反转录，制备实时荧光定量 的
15 MHCⅡ β-3'F1 GATGTTCAGACCCTCCAACTGG PCR
16 MHCⅡ β-3'F2 CCAGGTCTGGAGAGAAGATCTC cDNA 模板。

17 MHCⅡ β-CF CAGTGTTTGTCAAGTGAACC
1.5 细菌人工感染及中国花鲈腹腔注射 LPS、
18 MHCⅡ β-CR CTCTGATACTCTGCTGGTCT
Poly (I:C) 的体内刺激实验
19 MHCⅡ β-qF ACCTCTGATGTCACTTCCAC
中国花鲈人工感染所用的迟缓爱德华氏菌
20 MHCⅡ β-qR ATCGCCATCGGAGCCTCAGG
21 LM-ef1a-F ATCTCTGGATGGCACGGAGA (Edwardsiela tarda) 菌株由本实验室保种。菌种
22 LM-ef1a-R ATGCTAGCGGAACCACACTG 活化后，28 °C 扩大培养，通过平板菌落计数法
23 UPM-Short CTAATACGACTCACTATAGGGC 测定菌液浓度，用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤并
24 UPM-Long CTAATACGACTCACTATAGGGCA 梯度稀释菌液。
AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
通 过 预 实 验 ， 本 研 究 确 定 细 菌 脂 多 糖
25 NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
(LPS) 注射剂量为 800 μg /尾 (4 μg/g)，聚肌胞苷
26 APG CCAGACTCGTGGCTGATGCAGGG
GGGGGGGGGGGGG 酸 [Poly (I:C)] 为 1 mg /尾 (5 μg/g)，迟缓爱德华
27 AP CCAGACTCGTGGCTGATGCA 7
氏菌剂量为 4×10 CFU/尾，对照组注射相同体

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