Page 55 - 《水产学报》2025年第5期
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陈涵，等                                                                  水产学报, 2025, 49(5): 059605

              dH O 4 μL、步骤     1  反应液   10 μL，反应条件为            1.6    数据分析
                 2
              37 °C 15 min，85 °C 5 s，4 °C。                         所得数据以平均值±标准差               (mean±SD) 表
                   实验所用引物根据          NCBI 公布的中华绒螯              示，采用     SPSS Statistics 20.0  软件对数据进行单
              蟹相关基因，利用          Primer Premier 5 软件设计引         因素方差分析     (One-Way ANOVA)，采用      Duncan  氏
              物  (表  1)。                                       法进行多重比较分析，采用双因素方差分析
                                                               (Two-Way ANOVA) 探讨胁迫时间和碱度对中

                        表 1    实时荧光定量    PCR  引物
                                                               华绒螯蟹抗氧化能力及发育相关基因的影响，
                        Tab. 1    Primers for qRT-PCR
                                                               以     P<0.05  为显著差异水平。
                基因       引物              序列(5′→3′)
                gene    primer         sequence(5′→3′)
                                                               2    结果
                AKT    qAKT-F   GAGCACATCAAGAACTGGCGAC

                       qAKT-R   CAGACTCCGTAGCCCCACCAG
                                                               2.1    急性碱度胁迫下中华绒螯蟹抗应激及发育
                mTOR   qmTOR-F  GGTCCTGAATCAGAGGAACAGTCG
                                                               关键基因的表达
                       qmTOR-R  CAGAATGGAGATGGCATGTTCC
                                                                   碱度胁迫      6 h，与对照组相比，AKT           基因
                β-actin  qβ-actin-F  GTACCACCGGCATCGTGCTC
                                                               的表达水平显著升高           (P<0.05)，胁迫    12  和  24 h
                       qβ-actin-R  GATGTCTCGCACGATTTCTCGC
                                                               后显著降低      (P<0.05)，但仍显著高于对照组水
                                                               平  (P<0.05)。碱度胁迫       6 h，与对照组相比，
                   采用嵌合荧光法进行实时荧光定量                  PCR  扩
                                      TM
              增反应，按照        PrimeScript  RT Master Mix (Per-   mTOR  基因的表达水平显著升高             (P<0.05)，并且
                                                               在  12、24 h  均持续高表达，均显著高于对照组
              fect Real Time) [ 宝日医生物技术      (北京) 有限公
                                                               (P<0.05) (图  1)。双因素方差分析结果显示，胁
              司  ] 说明书进行操作。总反应体系               25 μL，其中
                                                               迫时间和碱度对         AKT、mTOR    基因表达的影响
              TB  Green  Premix  Ex  TaqⅡ (Tli  RNaseH  Plus)
                                                               均显著    (P<0.05)，且交互作用对          AKT、mTOR
              (2×)12.5 μL、 PCR Forward Primer (10 μmol/L) l    基因表达的影响也显著            (P<0.05) (表  2)。

              μL、 PCR Reverse Primer (10 μmol/L) l μL、 RT
                                                               2.2    急性碱度胁迫对中华绒螯蟹抗氧化酶活性
              反应液     (cDNA  溶液) 2 μL、灭菌水       8.5 μL。反
                                                               的影响
              应条件：预变性         95 °C 30 s；PCR  反应  95 °C 5 s，
              60 °C 30 s，循环    40  次。以   β-actin  为内参，对            碱度胁迫     6 h  中华绒螯蟹     CAT  活性显著降
              各样品     C 值进行均一化处理，用            2 −∆∆C t  法计算    低  (P<0.05)，随着胁迫时间的延长，CAT              活性
                       t
                                                               并 无 显 著 变 化    (P>0.05)， 均 显 著 低 于 对 照 组
              不同应激时间点目的基因相对表达量。

                                                               (P<0.05)。碱度胁迫      6 和  12 h，与对照组相比，
              1.4    抗氧化酶活性的测定                                 T-AOC  无显著变化       (P>0.05)，胁迫    24 h  时  T-
                   采集碱度胁迫各时间点中华绒螯蟹肝胰腺                          AOC  显著上升     (P<0.05)。碱度胁迫      6 h  后  MDA
                                                               的含量无显著变化           (P>0.05)，碱度胁迫       12 h，
              组织，测定        CAT  的活性、MDA       的含量和      T-
              AOC。酶活性的测定均采用南京建成生物工程                            随 着 胁 迫 时 间 的 延 长 ， MDA      含 量 显 著 上 升
                                                               (P<0.05) (图  2)。双因素方差分析结果显示，碱
              研究所试剂盒进行测定，其中总蛋白的测定采
                                                               度 对  CAT  活 性 的 影 响 显 著 ， 但 胁 迫 时 间 对
              用考马斯亮蓝法。
                                                               CAT  活性的影响不显著          (P>0.05)，二者的交互

              1.5    肌肉  H.E  染色石蜡切片的制作                        作用也不显著        (P>0.05)。胁迫时间和碱度对           T-
                                                               AOC、MDA     含量的影响均显著，且交互作用也
                   采集各胁迫时间点中华绒螯蟹步足肌肉组
                                                               显著  (P<0.05) (表  3)。
              织，固定于       Bouin  氏液中，以制作        H.E  石蜡切
              片：梯度酒精脱水→石蜡包埋→切片                     (厚度约        2.3    急性碱度胁迫对中华绒螯蟹肌肉组织结构
              为  5 μm)→展片→H.E      染色→中性树胶封片→过                 的影响
              夜干燥→显微镜观察→拍照。依据基因荧光定                                 荧光定量分析结果显示，碱度胁迫                    6 h时
              量分析结果，选择相应胁迫时间点进行组织学                             差异显著。对        0  和  6 h  中华绒螯蟹的步足肌肉
              分析。                                              进行组织学分析          (图版)，发现其步足肌肉为

              中国水产学会主办  sponsored by China Society of Fisheries                          https://www.china-fishery.cn
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