Page 46 - 《水产学报》2025年第5期

胡澄溪，等 水产学报, 2025, 49(5): 059104

1.5 TAG 的棒状色谱分析 1.8 数据分析
采 用 日 本 雅 特 隆 (Iatroscan) 公 司 生 产 的 所有实验均重复 3 次，并使用 SPSS 17.0
MK-6S 型薄层色谱-氢火焰离子化检测器 (TLC- 软件单因素方差分析 (One-Way ANOVA) 中的
FID) 对样品的 TAG 进行定量分析。将储存氢 LSD 多重比较进行显著性分析。
气的钢瓶 (0.2 MPa) 闸门打开，点燃氢气，接着
接通仪器的电源，打开开关，将氢气的流速调 2 结果
至 160 mL/min，并将空气的流速调至 2 L/min。
2.1 酵母细胞的显微结构与大小
启动 AC controller 并且启动 SCI480-Ⅱ软件。将
色谱棒架置入仪器，进行空白扫描 2~3 次。总 基于 Chen 等 [22] 及 Liu 等 [23] 报道的序列合
脂溶于 50 μL 氯仿，用取样器吸取 1 μL 样品， 成引物并按照其方法，首先自缺刻缘绿藻中分
分 5~6 次点样至色谱棒的原点，剩余总脂重新 别克隆到编码其 DGAT 类型Ⅰ和类型Ⅱ的 4 个
用氮气吹干保存。将色谱棒架放入盛有正己烷∶ 开 放 阅 读 框 (ORF) 的 cDNA 序 列 ， 然 后 转 化
乙醚∶冰醋酸=80∶20∶1 (体积比) 展开剂的展 TAG 合成的缺陷型酵母株 H1246，筛选到转基
开槽中。待展开至 100 mm 位置时，取出色谱 因酵母株。接着，利用油滴的特异性荧光染料
棒，在 65 °C 烘箱中烘 2~3 min。待色谱棒冷却 Bodipy 对酵母活细胞进行染色，在激光共聚焦
至室温后，将色谱棒架放入仪器检测。检测完 显微镜下观察，发现缺陷型酵母株 H1246 和
毕后，通过仪器自带软件查看色谱积分结果， pYES2 空载转化株 (tYES2)的细胞中均没有出现
对照 TAG 标样的上样量，用“样品峰面积×标样 油滴，而野生型酵母株 Scy62 却具有油滴 (图版)，
上样量/标样峰面积”来计算样品中的 TAG 量。 说明载体 pYES2 的转化不能使酵母恢复形成油
1.6 脂肪酸甲酯化 滴的作用。但在 4 个转目的基因的酵母株中均
出现油滴 (图版)，说明缺刻缘绿藻的 4 个 DGAT
将分离出的 TAG 粉末，加入 0.1 mg 的十
在 异 源 重 组 后 均 能 使 H1246 菌 株 成 功 恢 复
七烷酸作为内标，注入 1 mL 硫酸∶甲醇溶液=
TAG 的合成能力。这些回补实验的显微观察结
4∶96 (体积比)，充入氮气保护后，于 85 °C 水
果均与 Chen 等 [22] 及 Liu 等 [23] 报道的一致。
浴锅中甲酯化反应 50 min。将反应液转移入新
的离心管中，加入 1 mL 去离子水及 1 mL 正己 将上述获得的酵母株培养至稳定期，显微
测量其长、短轴，体积计算结果显示，H1246[V=
烷，剧烈振荡后 5 500 r/min 离心 5 min。小心吸
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(142.13±51.59) μm ，n=17] 和 tYES2[V=(143.87±
取上层溶液，用 0.45 μm 的亲水 PTFE 针式滤
55.45) μm ，n=16] 菌株的细胞体积略小于 Scy62
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器 (上海安谱实验科技股份有限公司) 过滤至酯
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菌株的水平 [V=(146.00±45.53) μm ，n=15]。转
化瓶中。氮气吹干后用正己烷复溶。
目的基因的酵母中，DGAT1 转基因株 tDGAT1
1.7 气相色谱-质谱 (GC-MS) 分析
的体积 [V=(153.87±53.46) μm ，n=16] 最大，tDG-
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使用美国安捷伦 7890A-5975C 型 GC-MS AT2A菌株 [V=(150.78±36.3) μm ，n=18] 次之，
联用仪对甲酯化的脂肪酸样品进行定性和定量 tDGAT2C菌株 [V=(143.59±27.10) μm ，n=17] 最
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分析。MS 采集参数选用 EMV 模式，跟踪检测 小。这 7 株酵母间的多重比较结果显示，细胞
的离子能为 70 eV (美国安捷伦公司)。GC 色谱 体积大小之间的差异不显著。以上结果表明，
柱为 HP-5MS 5% phenyl-ethylsiloxane 型毛细管 缺刻缘绿藻 DGAT 基因的引入对酵母细胞大小
柱 (250 μm×0.25 μm，30 m)。柱箱运行程序为 的影响可以忽略。
50 °C 保持 1 min，以 10 °C/min 升到 150 °C 保
2.2 酵母的生长性能
持 1 min，然后再以4 °C/min 升到 250 °C 保持 3
min。采用自动进样器上样，上样量为 2 μL， 本研究使用与细胞密度有关的 OD 60 0 值及
分流比为 50∶1。氦气为载气体，流速 1 mL/min。 与干物质累积有关的生物量来表征酵母细胞
脂肪酸组分鉴定参照质谱存储的数据库 NIST08 的生长性能。在批次培养过程中，H1246 和
MS。酿酒酵母的脂肪酸 (X ) 含量采用“X 的峰 tYES2 菌株进入稳定生长期时，其 OD 60 0 值分
n
n
面积/十七烷酸峰面积×0.1 mg”计算。 别 为 2.56 和 2.51 (图 1， 二 者 无 显 著 差 异 ，
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