Page 45 - 《水产学报》2025年第5期

胡澄溪，等 水产学报, 2025, 49(5): 059104

他生物特别是非模式生物去饱和酶 、延长 tDGAT2C 均按照 Chen等 [22] 及 Liu 等 [23] 的方法
[9]
酶 [10] 等脂肪酸合成相关基因功能鉴定的常用 构建并筛选获得。
工具。 Scy62 酵 母 株 及 转 基 因 酵 母 株 分 别 使 用
酵母在沿着两条合成代谢途径合成三酰甘 YPD 培养基及 SC-U 培养基培养。将菌株以体
油 (triacylglycerol，TAG) 的最后一步时，分别 积比 1∶1 000 的比例接种在对应的培养基中，
由酰基辅酶 A:二酰甘油酰基转移酶 (acyl CoA: 添加 2% 的葡萄糖后，在 28 °C 的摇床中，以
diacylglycerol acyltransferase，DGAT) 及磷脂:二 180 r/min 的转速培养 72 h，以活化菌株。
酰 甘 油 酰 基 转 移 酶 (phospholipid:diacylglycerol
1.2 生长曲线和生物量测定
acyltransferase，PDAT) 来催化完成，这两种酶
分别由基因 DGA1 [11] 及 LRO1 [12] 编码。当把它 将活化后的酵母菌株接种到 200 mL 的对
们以及编码甾醇酯 (steryl ester，SE) 合成相关的 应培养基上。每 8 小时测定各菌液的 OD 60 0 值，
酶基因 ARE1 和 ARE2 [13] 一并用可编程核酸酶扰 根据不同培养时间测量的 OD 60 0 值绘制酵母的
动后，所获得的突变株酵母 H1246 因无法合 生长曲线，并用“(稳定期−接种时的 OD 60 0 值)/
[14]
成 TAG 和 SE 等贮存脂，被广泛应用于微生 到达稳定期的时间”来计算酵母的生长速率。
物 [15-16] 、藻类 [17-18] 以及动植物 [19-20] TAG 合成代谢 待酵母生长至稳定期 8 h后，以 5 000 r/min
相关基因的功能鉴定与特征研究中。 的转速，离心收集一定体积菌液的酵母菌并用
Sandager 等 [14] 对酵母突变株 H1246 的研究 冰的灭菌水洗涤 3 次。使用冷冻干燥机 (美国

结果表明，TAG 不是酵母生长的必需物质。但 Labconco 公司) 冷冻干燥 24 h得到酵母粉。用
作为贮存脂的 TAG，在合成与累积的过程中， “单位体积的酵母干重/培养时间”来计算酵母生
[21]
必然需要消耗大量的脂肪酸和能量 ，因而可 物量的生产率。
能间接地影响酵母的生长。在利用该突变株进 1.3 激光共聚焦显微观察
行 DGAT 的基因功能鉴定时，人们所关注的是
取培养至稳定期的新鲜酵母菌液 1 mL，直
目的基因的表达及其产物的功能。而有关这些
接 加 入 1 μL 的 油 体 特 异 荧 光 染 料 Bodipy
目的基因的转化对酵母生长特性及脂质组成的
(Genmed Scientifics Inc.，美国)，暗室中孵育 10
影响知之甚少。为此，本研究在已构建的 4 株
min 以染色。在激光共聚焦显微镜 (Carl Zeiss，
转缺刻缘绿藻 (Myrmecia incisa) DGAT 的酵母细
德国) 下观察并拍照。激发波长 490 nm，发射
胞株 [22-23] 基础上，从细胞密度、单位体积生物
波长 515 nm。
量、生物质生产率、总脂、TAG 等方面比较分
析转目的基因细胞系与突变株 H1246 之间的差 1.4 总脂提取
异，以揭示外源的 DGAT 是如何影响酵母的生
利用改进的 Blight & Dyer 法 [24] 提取酵母总
长性能与脂质含量，为利用基因工程改造的酵 脂。精确称取 50 mg 冷冻干燥的酵母粉放入洁
母菌株生产人类需要的目的油脂奠定基础。
净的离心管中；加入 3 mL 的氯仿-甲醇溶液 (氯
1 材料与方法 仿∶甲醇∶BHT 甲醇=2.0∶0.9∶0.1，体积比)
和 400 μL 酸洗过的玻璃珠 (直径为 0.4~0.6 mm，
1.1 菌种及培养 美国 Sigma 公司)，涡旋振荡约 50 min，镜检发
酿酒酵母的 TAG 合成缺陷型株 H1246 (基 现酵母细胞完全破碎。然后，以 5 000 r/min 的
因 型 为 MATα are1-Δ::HIS3 are2-Δ::LEU2 dga1- 转速离心 15 min，取上清液至新的离心管。加
Δ::KanMX4 lro1-Δ::TRP1 ADE2) 以及作为野生型 400 μL 的 50 mmol/L 柠檬酸溶液和 600 μL 的氯
的酵母株 Scy62 (基因型为 MATa ADE2) 均由瑞 仿，振荡使混合物混匀，再以 5 000 r/min 的转
典农业科学大学 Sten Stymne 博士惠赠。转空 速离心 15 min；离心完毕后，用一次性注射器
载 pYES2 的 酵 母 tYES2以 及 转 缺 刻 缘 绿 藻 将最下层溶液 (管内以蛋白层为中间界限，分上
DGAT1、DGAT2A、DGAT2B、DGAT2C 等基因 下两层) 吸取至酯化瓶中。用氮气吹干酯化瓶中
的 酵 母 株 tDGAT1、 tDGAT2A、 tDGAT2B 和 的有机试剂，得到酵母总脂，称重。

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